In Vivo Matrix Gel Plug Assay 用の血管細胞の調製

まず、460ミリリットルの内皮細胞培地を使用して完全な内皮培養培地を調製し、そこに50ミリリットルのFBS、5ミリリットルのペニシリンストレプトマイシン、および5ミリリットルの内皮細胞増殖サプリメントを加えます。調製した培地は、摂氏4度で1ヶ月間保存できます。次に、10万個の血管細胞を含む100ミリメートルの組織培養皿に、調製した完全内皮培養液8ミリリットルで、70%のコフルエントが得られるまで、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で培養した。

次に、培養液を皿から取り出し、PBSで細胞を2回すすぎ、付着していない細胞や破片を取り除きます。PBSを除去した後、2.21ミリモルのEDTAを含む0.25%トリプシン3ミリリットルを細胞に加え、37°Cで1分間インキュベートします。40倍倍の倍率の光学顕微鏡で細胞の剥離を確認します。

7ミリリットルの完全内皮培養培地でトリプシンを中和し、培養皿から細胞を静かに洗い流します。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに400gで10分間回収した後、遠心分離します。上清を除去した後、5ミリリットルの完全内皮培養液に細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、200万個の細胞を含む計算された量の懸濁液を1.5ミリリットルの滅菌チューブに移します。

懸濁液を400Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化してから、上清を除去します。これで、血管細胞をマトリックスゲルと混合してマトリックスゲルプラグアッセイを行う準備が整いました。