偏光感受性2光子顕微鏡システムを構築してアライメントした後、表示された概略図に従って、アモルファスポリマーに実装されたフルオレセインなどの等方性参照サンプルを使用して、光学系アライメント品質をテストします。これを行うには、励起レーザーをオンにして、ゼロ半波長プレートの参照サンプルの360度極性グラフを測定します。試料面のX軸とY軸に対応するように半波長板の角度を調整し、両方のフォトダイオードが2つの光子励起発光成分の強度が同じかどうかを確認します。
試料を分析するには、この球晶石試料を含むスライドガラスを圧電ステージに取り付け、カバースリップを含むスライドの表面が高開口数浸漬対物レンズに面するようにします。次に、スライドガラスをテープで固定します。次に、顕微鏡のノブを使用してX、Y、Zの位置を調整し、溶液中の球晶石に対物レンズの焦点を合わせます。
球状突起の直径は通常数十ミクロンの範囲であるため、構造全体の中央領域に特に注目してください。次に、この球状突起を顕微鏡面の視野の中心に配置します。X方向とY方向のピエゾステージのステップ数を調整して、構造の領域全体をカバーすることで、XYスキャンのサイズを決定します。
スキャン速度、ステップサイズ、範囲などのピエゾステージパラメータを調整して、スフェルライト全体の領域をカバーします。シャッターを開き、フォトダイオードをオンにして、X軸とY軸に対応して偏光された励起ビームについて、選択したスキャン領域の1ステップごとに2光子励起蛍光強度のXおよびY発光成分を収集します。次に、この球状石サンプルをスキャンして、2光子励起蛍光を発生させます。
サンプル上の特定のスポットから完全な偏光分析を実行するには、励起ビームをオフにします。分子の配向に関する情報がサブミクロンの分解能で必要とされるこの球状突起上の選択した場所に対応するピエゾステージの特定の座標を取ります。圧電ステージを調整して、指定されたX座標とY座標に視野の中心を設定します。
励起ビームをオンにした後、半波長板を180度回転させて、2光子励起蛍光のXおよびY発光成分のフル360度偏光解析を実行します。2PFMラスタースキャンを実施した後に得られたインスリン球状突起の画像は、球状突起について報告された画像と一致していました。また、X軸とY軸に沿った試料の励起に対応する半波長板の位置も確認しました。
極座標グラフは、選択した異なるスポットから完全な偏光解析を実行している間に変化しました。球晶石の外側では、PLOグラフはアーチファクトとランダムな信号ノイズスパイクの集まりのように見えました。X軸とY軸に沿って高度に秩序立った位置から適切に測定されたポリグラフは、蛍光色素の局所的な配向と組織に応じて異なる形状と形状を持っていました。
