Liberase-Based Enzymatic Purification of Microglial Cells Isolated from a Mouse Spinal Cord

まず、メスで、安楽死させたマウスの背側正中線に沿って後頭部から仙骨部まで切開します。実体手術用顕微鏡を使用して、腰椎まで層を慎重に解剖します。最後の肋骨弓を特定します。

最後の頸椎と仙骨を特定します。次に、脊椎を分離するために切り込みを入れます。一対の解剖鉗子を使用して、椎骨の背側椎弓切除術を行い、脊髄を摘出します。

末梢神経系を構成する孔から出てくる神経を取り除きます。次に、抜出した脊髄を解剖板に置きます。バンナハサミで、2ミリの大きさに切ります。

次に、ピースを2ミリリットルの平底マイクロチューブに移します。マイクロチューブに1ミリリットルのHBSS-LDワーキング溶液を加えます。混合物を摂氏37度で25分間インキュベートします。

5分ごとに混合物を激しくボルテックスするようにしてください。次に、各消化液の内容物を40ミクロンサイズのストレーナーに通します。次に、7ミリリットルのHBSSと2%FBSを加えて消化を中和し、残りの組織を粉砕します。

懸濁液を50ミリリットルのコニカルチューブに移し、220gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、1ミリリットルのマイクロピペットを使用して上清を捨てます。次に、ペレットを新しい15ミリリットルのコニカルチューブに2ミリリットルのHBSS-FBSに再懸濁します。

2ミリリットルの90%等張密度グラジエント培地をチューブに加え、混合物を160gで18°Cで25分間遠心分離します。最後に、トランスファーピペットで中間相を回収し、15ミリリットルのコニカルチューブに移します。細胞を10ミリリットルのPBSで洗浄し、さらに実験する前に、細胞を220gで摂氏5度で5分間遠心分離します。

抽出したミクログリア細胞の精製により、FACS染色で確認された最大99%の細胞収量が得られました。平均サイズが10マイクロメートルの二重陽性細胞が観察され、非活性化ミクログリアと一致しました。