まず、調製したPBS/BEV溶液を500マイクロリットル摂取します。それを3ミリリットルのPBSと混ぜ合わせ、1, 000マイクロリットルのピペットで穏やかに混合します。穴の開いた発泡スチロールプレートに31ミリリットルの超遠心チューブを置き、チューブに下向き矢印のラベルを付けます。
次に、1, 000マイクロリットルのピペットを垂直に保持し、チューブの底に3ミリリットルの50%イオジキサノール溶液を加えます。チューブホルダーをチューブ開口部の下のフォームプレートのレベルより少し上に置き、チューブを70度の角度に傾けます。1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、50%イオジキサノール溶液の上に3ミリリットルの40%イオジキサノール溶液を加えます。
次に、40%イオジキサノール溶液の上に20%イオジキサノール溶液を3ミリリットル重ねます。1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、調製した20%ヨジキサノール溶液の上に3ミリリットルの10%イオジキサノール溶液を加えます。次に、10%イオジキサノール溶液の上に3.5ミリリットルのPBS/BEV溶液を加え、チューブを静かに直立位置に戻します。
次に、穴の開いた発泡スチロールプレートに31ミリリットルの超遠心チューブを配置し、上向きの矢印でラベルを付けます。1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、2.5ミリリットルの60%イオジキサノール原液をチューブの底部に垂直に加え、500マイクロリットルのPBS/BEV溶液と組み合わせて、3ミリリットルの50%イオジキサノールBEV溶液を得る。ピペッティングで溶液を完全に混合します。
次に、40%、20%、10%のイオジキサノール溶液を順番に重ねた後、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、10%イオジキサノール溶液の上に3.5ミリリットルのPBSを加えます。PBSを使用した2本のチューブの重量を、合計重量をプラスマイナス0.005グラム以内に調整します。次に、チューブをバケツに入れ、160, 000 G で摂氏 4 度で 7 時間遠心分離します。
ピペッターを使用して、グラジエント超遠心分離モードで得られたフラクションを側壁に対して上から下に順次収集し、10本の別々の38.5ミリリットル超遠心チューブに入れます。次に、160、000Gで70分間、摂氏4度で画分を超遠心分離します。上清を取り除き、超遠心チューブを5分間反転させます。
次に、200マイクロリットルのピペットを使用して、200マイクロリットルの予冷PBSにペレットを再懸濁します。PBS/BEV溶液を清潔な1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。F1 から F10 までのフラクションを 1 つのグラジエント超遠心分離モードで得られたフラクションとして標識し、分析に進みます。
