Rod Cell Degeneration in Xenopus Tadpoles by CRISPR/Cas9-Mediated Rhodopsin Knockout

まず、鋭利なキャピラリーを取り、マイクロローダーチップを使用して、2〜10マイクロリットルのCRISPR Cas9リボ核タンパク質複合体またはコントロール溶液をロードします。その後、充填したキャピラリーをマイクロインジェクターハンドラーに入れます。細い鉗子で毛細血管先端を折って吐出量を10ナノリットルに調整します。

1細胞期の胚を、3%ポリスクロース溶液を含む100ミリメートルのペトリ皿に接着したグリッド上に配置します。マイクロインジェクターを使用し、実体顕微鏡下で、10ナノリットルの溶液を皮質領域、特に細胞質膜の下の動物極レベルに注入します。24時間後、フルオレセイン、リジン、デキストリンを蛍光実体顕微鏡で可視化し、適切に注入されたrho crispant胚を選択します。

rho crispant オタマジャクシ網膜のカスパーゼ 3 標識は、一部の桿体がアポトーシスを起こすことを示しました。組織学的染色により、核層は全体的に保存されているが、視細胞の外側のセグメントは著しく短縮していることが明らかになった。視細胞マーカーを用いたさらなる免疫染色分析により、桿体外側セグメントの変性が示されました。