まず、受精した鶏の卵を摂氏38度の加湿インキュベーターでインキュベートします。次に、HBSSでステージ30〜33のニワトリ胚の背側皮を解剖します。次に、カルシウムとマグネシウムを含まない生理食塩水を0.25%EDTAの2倍で15〜20分間インキュベートします。
時計職人の鉗子を使用して上皮とMESENCHYMEを慎重に分離し、分離した材料を氷の上に置かれたHBSSに移します。分離した間葉を15ミリリットルの遠心分離チューブに集め、PBS製の0.1%コラゲナーゼトリプシンを2ミリリットル加えます。次に、溶液を水浴中でインキュベートします。
次に、パスツールピペットを使用して、皮膚間葉を単一細胞懸濁液に分散させます。次に、10%のウシ胎児血清を含む8ミリリットルのDMEMを追加して、消化を停止します。細胞を233Gで5分間遠心分離します。
その後、ペレットを培地に再懸濁します。次に、細胞培養インサートを6ウェルディッシュのウェルに入れ、間葉系細胞の10マイクロリットルの液滴をインサートに滴下します。インサートの外側の井戸で、10%ウシ胎児血清を含む2ミリリットルのDMEMをピペットで掴みます。
5%の二酸化炭素と95%の空気を入れたインキュベーターで、プレーティングした細胞を37度で1時間インキュベートします。1ミリリットルのピペットを使用して、メッキされた間葉系液滴の上に無傷の上皮を移します。無傷の上皮を間葉上で平らにして、再構成された皮膚外植片を形成します。
インサートにメディウムの薄い層を残して、皮膚の外植片を半湿らせます。空気/液体界面を提供し、再構成された皮膚外植片をインキュベーター内で37度でインキュベートし、5%の二酸化炭素と95%の空気環境。ex vivo臓器培養物は、最初は均一に見えます:培養で2〜3日後に形成される短い羽芽と、培養で4〜5日後に形成される長い羽芽。
