まず、10マイクロモルのY-27632と2.5マイクロモルのCHIR-99021を含むオルガノイド培養培地を調製します。ECMをガットオンチップにコーティングした後、上部マイクロチャネルのバイパスチューブを開いたまま、上部マイクロチャネルからアウトレットチューブを外します。バインダークリップを使用して、下部マイクロチャネルの入口と出口の両方を固定します。
P100マイクロピペットを使用して、20マイクロリットルの細胞懸濁液を上部マイクロチャンネルの出口穴に加えます。バインダークリップを使用して、上部マイクロチャネルのバイパスチューブとインレットチューブを固定します。アウトレットチューブを上部マイクロ流路のアウトレット穴に再度取り付け、プロセス全体を通してチューブが開いたままになるようにします。
完了したら、バインダークリップを使用して上部マイクロチャネルの出口チューブを徐々に固定します。次に、顕微鏡で、細胞が上部マイクロチャネル全体に均等に分布していることを確認します。ガットオンチップデバイスと加湿した二酸化炭素インキュベーターを摂氏37度に置きます。
チップの上部マイクロチャネルに取り付けられたシリンジを、インキュベーター内に配置されたシリンジポンプに接続します。流量を毎時30マイクロリットルに設定し、上部マイクロ流路の着座媒体の連続フローを開始します。この間、下部のマイクロチャネルはクランプされたままにしておきます。
着席の翌日、培地をA-83-01のみを含むオルガノイド培養培地と交換します。上部マイクロ流路に単層が確立されたら、下部マイクロ流路への連続的な着座媒体の流れを開始します。次に、オルガノイド培養培地を上下両方のマイクロチャネルに導入して、チップ内の3次元形態形成の発達を開始します。
流量を毎時50マイクロリットルに増やし、ガットオンチップ設計で1平方センチメートルあたり0.02のシアーストレスを達成します。コンピュータ制御バイオリアクターを使用して、ガットオンチップデバイスで2〜3日間培養した細胞に10%のサイクリックひずみと0.15ヘルツの周波数を適用し、3次元形態形成を確立します。培地フローの6〜9日後、イヌ腸上皮細胞の3次元形態形成の時折のクラスタリングがマイクロチャネル全体で観察されました。
免疫蛍光染色により、マイクロ流体チップ中のオルガノイド由来単層および絨毛様構造の立体構造を評価しました。TEERで測定した腸管バリア機能は、培養5日目に安定したTEER値を示しました。
