Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic β-Cells Using MtPhagy Dye

ベータ細胞マイトファジーのフローサイトメトリー解析に進み、研究する各所望の実験条件に対応する約100個の単離ミラーリング膵島を調製した単一細胞懸濁液を使用します。まず、各条件の膵島サンプルを500マイクロリットルの膵島流動培地に再懸濁します。0.25マイクロリットルのMtPhagyストックを、MtPhagy染料を受け取るために指定されたチューブに加えます。

同様に、0.25マイクロリットルのTMREストックとフルオジン-3-AMストックをそれぞれの指定チューブに加えます。チューブをアルミホイルで包み、各チューブを低速で5秒間ボルテックスして内容物を混合します。その後、チューブを摂氏37度で30分間インキュベートします。

インキュベーションの途中で、各サンプルを低速で5〜10秒間ボルテックスします。インキュベーション後、チューブを350Gで10°Cで1分間遠心分離します。上澄みを捨てます。

そして、サンプルを500マイクロリットルの膵島流媒体に再懸濁します。DAPI処理が必要なサンプルを含む微量遠心チューブにDAPIを添加します。再度遠心分離し、前述のように上清を廃棄します。

残渣を500マイクロリットルの膵島流動培地に再懸濁します。最後に、サンプルを氷上に置き、フローサイトメトリーに進みます。前方散乱光(FSC)と側方散乱(SSC)の電圧を調整して、細胞集団が散布図の中心になるようにします。

マルチプレットを除外するには、FSCの高さとFSCの幅、次にSSCの高さとSSCの幅の矩形ゲートで行います。DAPIの電圧と補正を調整して、生ベータ細胞をフィルタリングします。未染色のRFDサンプルに基づいて、使用する各蛍光色素の蛍光ゲートを設定します。

ゲートが確立されたら、サンプルごとに 10, 000 のイベントを収集します。マイトファジーの利用率が高いベータ細胞は、第3象限または第3四半期において、フルオジン高MtPhagy高TMRE低集団として定義されました。基礎およびバリノマイシン誘発性マイトファジーレベルは、RFDおよびHFD膵島の両方で特徴付けられました。