まず、麻酔をかけたマウスを採取し、1%トロピカミドと2.5%フェニレフリンを1滴眼に塗布して瞳孔を拡張します。次に、角膜に眼科用ジェルを塗布して、乾燥と麻酔による白内障を防ぎます。次に、無菌環境に直接光路を持つ直立手術用顕微鏡を設置し、網膜下注射を行います。
10マイクロリットルのガラスシリンジを準備するには、ニードルハブを取り外し、33ゲージの鈍いニードルを取り付けます。金属製のハブカバーを取り、針をシリンジにしっかりと固定します。針を蒸留水で洗い流して、漏れと針の開存性をテストします。
次に、シリンジを空にして、慎重に脇に置きます。.次に、麻酔をかけたマウスをクッションの上に置き、治療眼を顕微鏡の対物レンズに向けます。0.5%proparacaineの塩酸塩を加え、30秒待ちます。
次に、150マイクロリットルの眼科用ジェルを目に塗布し、丸いカバースリップを貼り付けます。角膜、虹彩、瞳孔、水晶体、結膜を観察して予備的な眼科検査を行います。焦点面を調整して、瞳孔を通してマウスの眼底を視覚化します。
次に、視神経頭が瞳孔の中心に揃うように頭を合わせます。その後、HESC由来の光受容体前駆細胞を含むチューブの基部を軽くたたいて、均一な細胞懸濁液を得ます。10マイクロリットルのガラスマイクロリットルシリンジと33ゲージの鈍い針を使用して、2マイクロリットルの細胞混合物を採取します。
30ゲージの使い捨て針を使用して、リンバスの2ミリメートル後ろに硬化切除創を作成します。レンズとの接触を防ぐために、針の角度を約45度に維持します。針先が目の中に見えるようになったら、慎重に針を引っ込めます。
針刺しによる怪我を防ぐために、使用済みの針を鋭利なビンに捨ててください。次に、ガラス注射器を取り、鈍い針を硬化切除術の傷口に挿入します。鈍い針をレンズに触れずに進めて、侵入創の反対側の網膜に到達します。
強膜の圧力分岐が見られるまで、網膜を静かに貫通します。次に、シリンジに穏やかな圧力を維持しながら、2マイクロリットルの細胞懸濁液またはPRDM培地を網膜下腔に注入します。目に見えるブレブの形成は、注入が成功したことを示します。
セルが落ち着くまで10秒待ちます。針を目からそっと引っ込めます。ブレブを視覚化するには、マウスヘッドを動かして顕微鏡の下で目の位置を調整し、ヘッドをそっと保持して位置を固定します。
術中OCTの場合は、手術用顕微鏡のIOCT機能を使用し、OCT画面でキューブを選択します。矢印ボタンを押して、スキャン領域をブレブに配置します。OCT、スライドセンタリング、フォーカスを調整してOCT品質を最高にするには、キャプチャまたはスキャンを押してブレブ領域のOCTスキャンを取得し、画像を確認してスキャンの品質を確認します。
最後にカバースリップをはがし、ガーゼを使って目元からジェルをやさしく拭き取ります。注射後、感染予防のため抗生物質軟膏を一度投与してください。OCTスキャンにより、細胞処理された眼に懸濁した明確なHESC実体が明らかになりました。
対照的に、培地で処理された眼は、網膜下腔内に細胞が空洞化した濁りのない液体を示しました。
