まず、シース液タンクに6リットルの脱イオン水に30グラムの塩化ナトリウムを加え、タンクを振って塩を溶かします。次に、タンクをセルソーターに接続します。セルソーターをオンにし、流路系を始動し、流路系が平衡化するのを待ちます。
ドロップ遅延を設定します。酵母エキス原液を調製するには、炭素13酵母エキス1アリコート1分を7.5ミリリットルの超純水と2.5ミリリットルのメタノールに再懸濁します。次に、抽出緩衝液を調製するために、10ミリリットルのアセトニトリルに10マイクロリットルの炭素13酵母抽出原液を加え、よく混合します。
25マイクロリットルの抽出バッファーを96ウェルPCRプレートの各ウェルに加え、ウェルを蓋で覆います。プレートをセルソーターに置き、ソートされた細胞を回収します。Alexa Fluor 647陽性集団とPE陰性集団のそれぞれ5000のイベントを最初の4つのウェルにソートします。
次に、PE陽性集団とAlexa Fluor 647陰性集団のそれぞれ5000のイベントを次の4つのウェルにソートします。次に、造血幹細胞について、PE-Cy7 low、PE陽性、APC-Cy7陽性、Brilliant Violet 605陽性、Brilliant Violet 421陰性の5000イベントを最初のウェルにソートし、続いてPE-Cy7 low、PE陽性、APC-Cy7陽性、Brilliant Violet 421陽性、Brilliant Violet 605陰性の5000イベントを次のウェルにソートします。デブリサンプルの場合、前方散乱信号と横方向散乱信号に基づいて、無傷の細胞を表すには小さすぎるイベントを選択します。
次に、LC-MS装置の電源を入れます。サンプルプレートを装置のオートサンプラーに入れます。LC-MS対応ソフトウェアを開き、分析用の装置を準備します。
少なくとも 4 つのプロセスブランクまたはプールサンプルを分析してカラムを平衡化し、LC テストミックスを平衡化してクロマトグラフィー性能を確認します。初期背圧と最大背圧がそれぞれ150バールと400バール未満であることを確認します。次に、保存期間が 1 分以内になるようにします。
次に、正の 132 から 86 への遷移におけるロイシンとイソロイシンの間の谷がピーク高さの 20% 未満であることを確認します。最後に、AMP と ADP の保持時間の差が 1.5 分から 1.9 分、ADP と ATP の保持時間の差が 1.1 分から 1.5 分であることを確認します。実験パラメーターを確認したら、LC テストミックスからのキャリーオーバーを最小限に抑えるためにプロセスブランクまたはプールサンプルで分析を設定し、その後にテストサンプルをランダムな順序で実行します。
FACSソーティングにより、同じ細胞懸濁液から異なる細胞タイプの純粋な集団を単離することができます。造血幹細胞および多能性前駆細胞のFACS細胞CMSプロトコルを使用して、同じ組織からの細胞タイプ間の代謝の違いを保存しました。6匹のマウスの細胞から6つのサンプルを生成する必要があり、同じマウスの脾臓から選別されたB細胞とT細胞と比較して、各グループ内のばらつきが大きくなりました。
プロセスブランクコントロールサンプルを表すデブリサンプルは、細胞抽出物を含むサンプルから明確に分離されました。ここでは、異なる細胞タイプにおける代謝物の相対レベルに関する情報を示すヒートマップを示します。
