凍結保存した血液サンプルを融解して培養した後、室温で必要なX線量を照射します。次に、1.62ミリリットルの温かいRPMI培地を各ウェルに添加します。Tリンパ球の細胞分裂を刺激するために、各ウェルに40マイクロリットルのフィトヘマグルチニンを加え、完全に再懸濁します。
プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で23時間インキュベートします。翌日、ウェルあたり8マイクロリットルのサイトカラシンBを添加して、細胞質分裂をブロックします。70時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。
各ウェルを2ミリリットルのPBSで洗い流し、このPBSを15ミリリットルのチューブに加えます。細胞懸濁液を180 Gで8分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットの上に500マイクロリットルを残します。ペレットをボルテックスしながら、2ミリリットルの冷たい塩化カリウムをチューブに加えます。
ここでも、前に示したように上清を遠心分離して廃棄します。2ミリリットルの低温固定液1をゆっくりと加えてペレットをボルテックスし、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、遠心分離機にかけ、上清を捨てる。
ペレットを滴下しながら、2ミリリットルの低温固定液2をチューブに加えます。チューブを摂氏4度で一晩放置します。サンプルを遠心分離し、上清を別のチューブに移して、ペレットサイズに応じて細胞を濃縮します。
スライドをイソプロパノールで洗浄し、適切にラベル付けします。ペレットをボルテックスした後、40マイクロリットルの固定細胞懸濁液をスライドに加えます。乾燥後、スライドをアクリジンオレンジ染色液に1分間浸します。
次に、スライドを蒸留水ですばやく洗浄してから、リン酸緩衝液に1分間入れます。スライドの裏側を乾かし、清潔なティッシュペーパーの上に置きます。20マイクロリットルのリン酸緩衝液をスライドに加え、気泡を避けて清潔なカバースリップで覆います。
スライドをシリコンセメントで密封します。スライドを蛍光顕微鏡の下に置き、二核細胞を調べます。最後に、小核を手動で数えます。
丸みを帯びた二核細胞の存在は、凍結保存された全血サンプルから健康な生細胞の回収に成功したことを示しました。放射線量の増加に伴い、小核収量の線形二次増加が観察された。偽照射された対照サンプルにおけるバックグラウンド小核の産出は、主に染色体の遅れに起因します。
