まず、外用溶液を酸素化生理食塩水で5分間灌流します。ピペットで、10マイクロリットルの解剖液をペトリ皿に移します。次に、注射針と顕微鏡を使用して、麻酔をかけた確立された野生型とノックアウトハエの脳を注意深く解剖します。
ピペットで、準備した脳を5ミリリットルの外用溶液を入れた記録皿に移します。Cシャープホルダーで脳を固定します。次に、各脳の共焦点画像を20倍でキャプチャします。
XYTスキャンモードを使用し、さらに4.5倍のデジタル増幅でキノコ体ニューロンを識別します。レーザー励起を488ナノメートル、16マイクロワットのレーザー出力に設定して、全脳GCaMP6m発光を取得します。次に、スキャンパラメータを1400の速度、ピクセルサイズを256 x 256ピクセルに設定します。
アクイジション・レートを5.3ヘルツに設定し、3分間録音します。5〜8つの関心領域の蛍光を分析します。キノコ体ニューロンの細胞体を関心領域として手動で決定します。
画像 J を使用して、同定されたニューロンを標識し、その蛍光強度を測定します。GCaMP6mの蛍光データを図のように解析します。2 標準偏差から 2.5 標準偏差の間で増加する細胞内蛍光を小さなスパイクとして定義し、2.5 標準偏差を超えて増加する細胞内蛍光を大きなスパイクとして定義します。
カルシウムシグナルは、ハエのキノコの体で観察されました。CACノックダウンバエは、小さなトゲよりも大きなトゲを多く示しました。