まず、成長因子還元細胞外マトリックスゲルをコーティングした6ウェル組織培養プレート上のIPSC維持培地でiPS細胞を培養します。細胞が80〜90%vに達したら、プレートから培地を取り出し、DPBSで細胞を一度洗浄します。次に、700〜800マイクロリットルの0.48ミリモルEDTAを加え、室温で1分間インキュベートします。
分解液を取り除き、プレートを摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。細胞がシート状に消化されたら、2ミリリットルのIPSC維持培地を添加して消化を終了します。細胞懸濁液を6ウェル低付着プレートに移します。
細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%、60RPMでインキュベートし、球状の胚体またはEBを形成します。24時間後、過去のピペットを使用して、EBを遠心分離管に移し、5〜10分間沈殿させてから上清を除去します。MSC分化培地をチューブに添加し、EBを2ミリリットルのMSC分化培地を入れた6ウェル低付着ブレードに移します。
シェーカーでEBを摂氏37度、5%二酸化炭素で7日間培養します。8日目に、前述したようにEBを遠心分離管に移します。EBが沈降したら、上清をチューブから取り出します。
MSC維持培地をチューブに添加し、EBを2ミリリットルのMSC維持培地で成長因子低減細胞外マトリックスゲルコーティングされた6ウェルプレートに移します。細胞接着後、培養物が90%のコンフルエントに達するまで培地を交換します。次に、EB由来培養物を37°Cの解離液で処理します。
細胞の一部が単一細胞に消化されたら、2ミリリットルのMSC維持培地を加えて消化を終了させ、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移します。ウェルから残った未消化の細胞をDPBSで一度洗浄します。そして、前に示したようにもう一度ダイジェストします。
次に、細胞懸濁液を250gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、ゼラチンコーティングされた培養プレートに細胞を播種します。細胞をMSC維持培地で90%のコンフルエントになるまで培養し、定期的な培地交換を行います。
前述したように、培養hiIPCsライン。細胞のコンフルエント度が50〜60%に達したら、IPSC維持培地をプレートから取り出します。2ミリリットルのMSC維持培地を追加します。
そして、摂氏37度、二酸化炭素5%で14日間培養し、毎日培地を交換します。MSCの成熟には、単層培養液を摂氏37度の解離溶液で処理します。細胞の一部が単一細胞に消化されたら、2ミリリットルのMSC維持培地をウェルに添加して消化を終了させ、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移します。
残りの未消化細胞をDPBSで一度洗浄し、前述のように消化します。次に、前に示したように細胞懸濁液を遠心分離し、ゼラチンでコーティングされた培養皿に細胞を播種します。細胞をMSC維持培地で90%のコンフルエントになるまで培養し、定期的な培地交換を行います。
EB形成法では、hiIPCコロニーは分化前はコンパクトな形態を示しました。解離後、均一な球状のEBが形成され、時間の経過とともに体積が増加しました。その後、EBは接着性単層細胞に形質転換し、18日目までに90%のコンフルエントを達成し、2継代後には紡錘体形状の形態を獲得しました。
同様に、単層法では、細胞が増殖し、多層接着細胞を形成した。複数回パッケージングした後、細胞は典型的な紡錘体形状と渦巻くコロニーを持つMSCに成熟しました。フローサイトメトリー解析により、hiIPCはCD90が陽性、CD34、CD45、CD105、およびCD73が陰性であることが明らかになりました。
分化後、間葉系幹細胞を駆動するhiIPCはCD90、CD73、およびCD105を発現したが、CD34およびCD45については陰性のままであった。単層由来のMSCは、EB法よりも高いカルシウム沈着形成を示しました。しかし、脂肪形成能力と軟骨形成分化能力に有意差は認められなかった。
両方の方法の増殖能力は、最大20継代まで維持されました。
