Quantification of mRNA in TMEM200A siRNA Transfected Stomach Adenocarcinoma Cells

まず、胃腺癌細胞にTMEM200A siRNAをトランスフェクションし、2日間インキュベートします。次に、ウェルから細胞培養培地を廃棄し、1ミリリットルのPBSで細胞を2回静かに洗浄します。RNA単離キットを使用して、細胞のトータルRNAを単離します。

製造元の指示に従い、cDNA合成キットを使用してRNA濃度を推定し、1マイクログラムのRNAでcDNAを合成します。次に、10 マイクロリットルの反応混合物中の cDNA を 10 倍希釈した定量的 RTPCR をセットアップします。リアルタイムPCRアッセイシステムを使用して、プライマーと定量PCRマスターミックスを添加します。

ここに示す定量的PCR反応条件を使用し、ダブルデルタCT技術を使用して各遺伝子の相対発現を決定します。HGC-27細胞株は、GES-1細胞株と比較してTMEM200Aタンパク質およびmRNA転写産物を劇的に過剰に発現しました。ヒト胃がん細胞SGC-7901におけるTMEM200AのmRNA発現差は、GES-1細胞よりも高い。