まず、胃腺癌細胞にTMEM200A Si-RNAをトランスフェクションし、2日間インキュベートします。次に、ウェルから細胞培養培地を廃棄し、1ミリリットルのPBSで細胞を2回静かに洗浄します。細胞を氷上に置き、150マイクロリットルの予冷した放射性免疫沈殿アッセイ溶解バッファーを添加します。
プラスチック製の細胞スクレーパーを使用して、接着した細胞を皿から慎重に取り外し、細胞溶液を予冷した微量遠心チューブに静かに移します。次に、細胞溶解液を1.5×10で遠心分離し、摂氏4度で10分間、4Gの累乗に昇華し、上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。BCAタンパク質アッセイキットを使用して、メーカーの指示に従ってタンパク質含有量を測定します。
各サンプルから30グラムのタンパク質を10%SDS-PAGEゲルにロードします。ゲルを80ボルトで0.5時間泳動し、続いて120ボルトで1.5時間泳動します。次に、タンパク質をゲルから45マイクロメートルのPVDFメンブレンに300ミリアンペアの定電流で1〜1.5時間移します。
PVDFメンブレンをシェーカーに置き、それぞれ5分間の3サイクルを待ちます。振とう後、TBSTをタンパク質面を上にして容器に入れます。メンブレンをブロッキングバッファーに入れ、室温で30分間加熱します。
メンブレンをTBSTで10分間ずつ3サイクル洗浄します。メンブレンを一次抗体と摂氏4度で一晩インキュベートします。メンブレンをTBSTで3回洗浄した後、ウサギまたはマウスの二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートします。
次に、ECL基質をPVDFメンブレンに30秒間添加し、イメージングシステムを使用してシグナルを検出します。Si-RNAをトランスフェクトした胃癌細胞HGC-27では、トランスフェクションしていない細胞と比較して、TMEM200A効率が有意に低下しました。Si-RNA TMEM200Aは、上皮間葉転換における関連タンパク質を有意に阻害し、ホスホイノシチド3-キナーゼシグナル伝達経路におけるAKTのリン酸化に影響を与えた。
