まず、EVtrapアプローチを使用して、尿サンプルから単離された細胞外小胞のプロテオームおよびリン酸化プロテオームサンプルを調製します。液体クロマトグラフィーシステムを介して、トラップ型イオンモビリティー飛行時間型質量分析計にサンプルを注入します。ペプチドを 15 cm の C18 カラムに分離します。
プロテオミクス解析では、ランプあたりの質量範囲が 300 から 1200 の質量電荷比、イオン移動度定数が 0.6 から 1.50 1/ノットの dia-PASEF メソッドを使用してデータを取得します。リン酸化プロテオミクス解析では、dia-PASEF取得法を用いてデータを取得します。ランプあたりの質量範囲を、質量電荷比が 400 から 1550 の範囲、イオン移動度定数が 0.6 から 1.50 1/ノットになるように設定します。
生ファイルをプロテオミクスソフトウェアにロードします。ホモ・サピエンス・データベースで検索パラメータを設定します。[Digest Type] で [Specific] を選択し、[Enzymes] で [TrypsinP] を選択します。
ペプチド長を最小 7、最大 52 に定義し、切断を 2 回逃すことを許容します。次に、[変数の最大変更数] を 5 に設定します。固定修飾はシスチンのカルバミドメチルであるべきですが、可変修飾はアセチルタンパク質のN末端、メチオニンの酸化、およびセリン、スレオニン、チロシンのリン酸化を含む必要があります。
最後に、ペプチドスペクトルの一致、ペプチド、およびタンパク質グループの偽発見率を 0.01 に設定します。LCMSおよびMSプロテオミクスプロファイリングでは、各サンプルの2%から、約2, 200のタンパク質から11, 000以上のユニークなペプチドが明らかになりました。特筆すべきは、72%のユニークなタンパク質が3つの複製すべてで一貫して見つかり、ExoCartaデータベースと比較して90の上位EVマーカーとタンパク質が同定されたことです。
定量精度は、5.7%の低中変動係数で確認され、高い再現性と信頼性を示しました。リン酸化プロテオミクスでは、各ペプチドサンプルの98%から、800の固有のリン酸化ペプチドと350のリン酸化タンパク質が得られました。濃縮により、72%のホスホセリン、22%のホスホスレオニン、および6%のホスホチロシンペプチドが得られました。
42%のリン酸化ペプチドがすべての繰り返しで同定され、中程度の変動係数は21.8%であり、許容できる定量再現性が示されました。
