High-Throughput Screening of Compounds Using Neutrophils Isolated from Human Blood in a 384-Well Plate Format

血清ピペットを使用して、15 mmリットルの遠心チューブ内で、4 ミリリットルのヘパリン処理ヒト血液を 8 ミリリットルの密度勾配培地に慎重に重ねます。550Gで20°Cで30〜50分間血液を遠心分離します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、血漿細胞と単核細胞を含む上層を取り除きます。

好中球を下部の濁ったバンドから採取し、透明な液体の約3〜4ミリリットル下から、10ミリリットルのPBSを含む15ミリリットルの遠心分離管に集めます。チューブを2〜3回静かに反転させて、好中球懸濁液を混合します。好中球懸濁液を400gで20°Cで10分間遠心分離し、上清をチューブから慎重にデカントし、ペレットを5ミリリットルのPBSに再懸濁します。

再度、懸濁液を300Gで20°Cで10分間遠心分離します。上澄み液を除去した後、真空吸引を使用して、チューブ壁とチューブ口の周りの残留上澄み液を除去します。ペレットを1ミリリットルの好中球培地に再懸濁します。

1.5ミリリットルのチューブに、1ミリリットルあたり1.2マイクログラムの抗体溶液と0.2ミリリットルの好中球培地を混ぜ合わせます。25マイクロリットルの抗体溶液を384ウェルプレートのネガティブコントロールウェルに加えます。15ミリリットルのチューブに、9ミリリットルの抗体溶液、21.6マイクロリットルのFMLP溶液、および1.7784ミリリットルの好中球培地を混ぜ合わせます。

この混合物を25マイクロリットルをポジティブコントロールに加え、384ウェルプレート内のテストウェルに入れます。マルチチャンネルピペットを使用して、5マイクロリットルの化合物溶液を化合物ライブラリプレートから384ウェルプレートに移します。懸濁液を500Gで1分間遠心分離します。

16チャンネルピペットを使用して、20マイクロリットルの好中球懸濁液を各ウェルに加えます。プレートをシェーカー上で300RPMで10分間インキュベートします。次に、細胞を固定するために、各ウェルに16%パラホルムアルデヒドを3マイクロリットル添加し、氷上で10分間インキュベートします。