Injecting bOpto-BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos

まず、インキュベーターとLEDマイクロプレートイルミネーターを使用して、光の露出と温度を制御するためのライトボックスを作成します。次に、インキュベーターの上部棚に6ウェルプレートを配置し、光線が均等にそれを囲むかどうかを確認します。紙を使用して、光の被覆率の分布を視覚化します。

照度計を使用して、放射照度と空間均一性を測定します。注射の少なくとも1日前に、注射皿とアガロースでコーティングされた6枚のウェルプレートを作ります。注入皿型を胚培地ですすぎ、脱皮とアガロースの上に静かに置きます。

アガロースが固まったら、タブを繊細に使用してカビを取り除きます。次に、脱塩素化胚の免疫蛍光実験用のフレームガラスピペットを調製します。ガラスピペットの端をパンとバーナーの炎に入れ、端が滑らかになるまで連続的に回転させます。

ここに示したmRNAを使用して注入ミックスを調製します。表現型アッセイでは、1細胞段階でコリオンを通して細胞の中心に直接針を導入し、1ナノリットルの注射ミックスを注入します。免疫蛍光アッセイを実施する場合は、コーティングされた胚の細胞の中心を1細胞段階で標的とします。

どちらのアッセイでも、未曝露、非注入、非曝露注射、ばく露非注射、およびばく露注入された胚に十分な胚を調製します。条件ごとに少なくとも 30 個の胚を選択します。免疫蛍光アッセイでは、発生段階の進行を評価するための代理として、非注入胚を含む追加のディッシュを準備します。

注入後、ペトリ皿で胚を摂氏28度でインキュベートします。