Light Exposure Experiment to Activate BMP or Nodal Signaling in Zebrafish

まず、注入したゼブラフィッシュの胚を摂氏28度でインキュベートします。4〜16細胞段階で約1.5HPFで、未受精胚や不健康な胚を取り除きます。表現型アッセイでは、未露光のコントロールプレートを非注入胚と注入胚でアルミホイルで包みます。

フォイルで覆われたプレートを下段の棚に、露出したプレートを摂氏 28 度のライト ボックスの上段の棚に配置します。ディッシュカバーが所定の位置にあることを確認したら、青色ライトをアクティブにし、ライトボックスのドアを閉めて、意図しない室内光の露出を防ぎます。1.5 HPF付近の免疫蛍光アッセイでは、曝露されたディッシュと曝露されていないディッシュをアルミホイルで個別に包み、プロキシディッシュは包装されていない状態で保持します。

LEDを作動させないで摂氏28度のライトボックスにすべての皿を置きます。ライトボックスのドアを閉めて、部屋の光に不注意にさらされないようにします。約5HPFで、解剖スコープを使用して代理胚の発生段階を評価します。

また、包まれた食器を取り外して、すべての食器で均一な温度にさらされるようにします。代理胚が40%epibolyに達したら、露出した皿の覆いを解き、ライト ボックスの上の棚に置きます。露出していない皿を下の棚に覆っておきます。

すぐに青いライトを点灯させ、ドアを閉め、タイマーを20分にセットします。固定の準備として、部屋の光をできるだけ排除します。固定の直前に、摂氏4度から4%ホルムアルデヒドを含むチューブを取り、ライトボックスの横に置きます。

20分後、ライトボックスのドアを開けて、光が当たっていない皿を取り外します。フレームガラスのピペットチップを使用して、光に敏感な胚を皿から取り除きます。次に、胚を4%ホルムアルデヒドに浸すには、フレームガラスピペットチップをホルムアルデヒドに浸し、胚を液体に沈めます。

固定胚は摂氏4度で一晩保管してください。