Introducing Human Cells into a Microfluidic Device to Investigate Tumor Progression in a Vascularized Micro-Tumor System

まず、UV滅菌したハイスループットプレートとトロンビンアリコートを組織培養フードに入れます。調製した細胞フィブリンミックスを氷上に置き、凝固を遅らせます。P20ピペットを使用して、6マイクロリットルの細胞フィブリン混合物を採取します。

次に、ピペットチップをトロンビンアリコートにそっと入れ、気泡を発生させずに2回混合します。ハイスループットプレートを斜めに持ち上げ、ピペットチップをローディングポートの1つにすばやく挿入します。ピペットプランジャーをスムーズで流動的な動きで最初の停止まで押し、細胞フィブリン混合物を組織チャンバーに注入します。

ゲルがチャンバーを完全に通過するようにします。ピペットチップを取り外したり、ピペットをずらしたりせずに、プレートを静かに平らに置きます。P20からピペットチップを手で取り外し、ローディングポートの穴に置いたままにします。

2分後、ピペットチップを緩やかにひねりながらローディングポートから取り外し、蓋をプレートに置きます。プレートを摂氏37度で15〜20分間インキュベートし、ゲル重合させます。マイクロ流体デバイスを顕微鏡ステージに置き、気泡のないチャンバー全体の細胞の均一な分布を観察します。

P20ピペットチップをM1またはM3に挿入し、4マイクロリットルのラミニンをゆっくりと排出してトップパネル全体をコーティングします。前述したようにピペットチップを取り外し、プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素中で10分間インキュベートします。275マイクロリットルのEGM-2完全培地を、275マイクロリットルのEGM-2を含むウェルの培地入口穴にP200ピペットチップをP200ピペットチップを投入し、媒体がチャネルを通って移動し、反対側で泡立つのを見て、75マイクロリットルの培地をゆっくりと排出します。

ピペットチップを取り外した後、残りの培地をチップから培地リザーバーに押し込みます。50マイクロリットルの培地を加えて、列GおよびHのローサイドウェルを完全に覆い、図のようにプレートを1〜2時間インキュベートします。顕微鏡下で、培地チャネル内の気泡を特定し、75マイクロリットルの培地をチャネルに再導入して気泡を取り除きます。

肉眼で中程度の入口または出口に気泡がないか確認します。次に、P200ピペットチップを穴に挿入し、プランジャーを持ち上げて気泡を引き出します。血管新生微小器官(VMO)では、内皮細胞は最初は組織室内に均等に分布していましたが、2日目までに伸びて発光し始めました。

4日目までに、内皮細胞は外側のマイクロ流体チャネルと吻合し、連続した血管ネットワークを形成しました。タイトな血管バリア機能は、微小血管ネットワークを介してFITC-デキストランを灌流し、漏出を最小限に抑えることで確認されました。MDA-MB-231がん細胞をVMOに灌流すると、内皮内膜への付着とそれに続く細胞外腔への血管外漏出が起こり、灌流後24時間以内に複数の微小転移が形成されました。

タイムラプス顕微鏡イメージングにより、VMOの細胞外空間へのT細胞の血管外漏出が45分にわたって観察されました。血管が完全に形成された血管新生微小腫瘍では、T細胞は灌流時に血管壁に急速に接着しました。