Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation

血清ピペットの使用を開始するには、コンフルエントMDA-MB-231培養物が70%入ったT75フラスコから増殖培地を取り出します。フラスコに3ミリリットルのトリプシンを加え、5%二酸化炭素で37度で3〜5分間インキュベートして、フラスコから細胞を分離します。次に、トリプシンを中和するために、フラスコに3ミリリットルのDMEMを加えます。

細胞懸濁液を遠心チューブに集め、400 Gで4分間離心させます。ピペットを使用して上清を廃棄し、ペレットを2ミリリットルのPBSに再懸濁します。セルカウンターを使用して、細胞濃度を測定します。

5番目の細胞に10を8回15ミリリットルのチューブに移し、PBSを加えて容量を1ミリリットルにします。次に、2マイクロリットルのCFSEをチューブに加え、1ミリリットルのピペットを使用して細胞懸濁液を完全に混合します。チューブを摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターに20分間置きます。

次に、5ミリリットルのDMEMをチューブに加え、遠心分離してCFSE標識細胞をペレットダウンします。上清を廃棄し、ペレットを1ミリリットルのDMEMに再懸濁します。細胞濃度を再評価した後、10×4を5番目の細胞に移し、25ミリリットルの試薬リザーバーに移します。

DMEMを添加して容量を8ミリリットルにし、細胞懸濁液を5ミリリットルの血清ピペットで混合します。マルチチャンネルピペットを使用して、100マイクロリットルの細胞懸濁液を黒色の96ウェルプレートの左半分の各列に移します。同様に、プレートの右半分にEGFRノックアウト細胞懸濁液を添加します。

細胞の分布を均一にするために、プラットフォーム上でプレートを前後左右に動かします。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で4時間インキュベートし、腫瘍細胞を付着させます。形質導入されていないJurkat細胞とCARを発現するJurkat細胞の数に基づいて、5番目のCAR-J細胞に10の4倍を25ミリリットルのリザーバーに移します。

DMEMをリザーバーに添加し、最終容量が2ミリリットルになるようにします。エフェクターと腫瘍の比率が4:1の場合、ウェルの側面に沿って100マイクロリットルの培地で、ウェルあたり4番目のCAR-J細胞に10倍の2倍を加えます。次に、腫瘍細胞とJurkat細胞を含むウェルの側面に100マイクロリットルのDMEMを加えて、ウェルあたり300マイクロリットルの体積を得ます。

腫瘍細胞上のJurkat細胞が均一に分布するように、図のようにプレートを動かします。共培養を摂氏37度、5%二酸化炭素で48時間確立します。