Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR-Jurkat Co-Culture with CFSE-Labeled Tumor Cells

ジャーカットを発現するCARとCFSE標識腫瘍細胞を共培養した後、ペーパータオルの上でプレートを静かに反転させ、タップしてCAR-Jを含む上清を捨てます。マルチチャンネルピペットを使用して、プロピジウムヨウ素(PI)を含む100マイクロリットルのFluoroBrite DMEM培地を、接着した腫瘍細胞を乱すことなくウェルに添加します。次に、20マイクロリットルの20%Triton Xを各腫瘍タイプの最初のウェルに追加し、完全なデッドコントロールとして使用します。

イメージングする前に、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で20分間インキュベートします。蛍光イメージング後、細胞の腫瘍専用ウェルの1つを使用して、緑色蛍光チャネルをキャリブレーションします。ウェルの端にある細胞を除外するには、ウェルマスクを98%に減らします緑色蛍光チャネル上のCFSE標識腫瘍細胞を同定し、蛍光強度の閾値を調整して、ウェル内のすべての細胞を捕捉します。

最小セル直径を 25 マイクロメートルに設定して、CFSE チャネルで検出された破片を除外します。次に、個々のセルを識別するために、個別のタッチオブジェクトを有効にします。次に、生細胞集団と死細胞集団を定義するゲートを設定します。

CFSE でラベル付けされたセルを選択し、Y 軸の度数と X 軸の平均 PI 強度のヒストグラムを生成します。x軸の値を調整して細胞を可視化し、スプリッターを描画して低PI染色細胞と高PI染色細胞を区別します。低PI染色細胞を生細胞として標識します。

次に、x軸に面積、y軸にカウントを持つ生細胞に別のヒストグラムを設定します。デブリ以外の細胞を大きな生細胞としてラベル付けします。次に、腫瘍だけをうまく使って別のスプリッターを引いて細胞を捕捉し、破片をろ過します。

プレート全体で解析を実行した後、数値を含むスプレッドシートをエクスポートします。大きな細胞の数をプロットして、CAR-Jへの曝露後にウェルに残っている生きたCFSE標識腫瘍細胞の数を決定します。最後に、一元配置分散分析を使用して統計分析を実行します。

CAR-J1の細胞毒性は、エフェクターと腫瘍の比率が高いほど増加し、エフェクターと腫瘍の比率が4対1で50%以上の死滅が観察されました。ヒンジドメインを修飾したEGFR標的CARコンストラクトは、MDA-MB-231細胞を発現するEGFRに対して抗原特異的な死滅を示し、EGFRノックアウト細胞に対して有意な死滅は観察されませんでした。CARコンストラクトは、PBMC由来のCD3 T細胞にも発現していました。

しかし、CD8ヒンジ含有EGFR-CARの発現は認められなかった。IgGショートは、IgGロングおよびIgG培地と比較して、MDA-MB-231細胞に対する細胞傷害性が最も低い効力を示しました。