まず、35mmのカバーガラス皿をポリ-D-リジン(PDL)でコーティングします。これを行うには、カバーガラス皿の中央に0.5マイクロリットルのPDL液滴を分注します。10マイクロリットルの目盛り付きピペットを使用して、カバーガラス全体にPDL液滴を塗ります。
コーティングされたカバーガラス皿を摂氏37度で10分間乾燥させます。AcroSensEを発現するマウスモデルから新たに採取された精子をイメージングするには、調製した精子懸濁液80マイクロリットルをPDLコーティングカバースリップディッシュの中央に加えます。次に、摂氏37度に予め温めた3ミリリットルのサプリメントを添加したホイッテンのベース培地を皿にゆっくりと加えます。
顕微鏡と単一細胞刺激剤送達セットアップの組み合わせを使用してイメージングを実行します。まず、精子の入った皿を顕微鏡に取り付けます。次に、マイクロマニピュレーターを用いて、覚醒剤送達システムの毛細血管先端を、目的とする細胞の平面から約100ミクロン上方に、側面に約100ミクロン上方に配置する。
毛細血管を精子頭から100ミクロン以内に配置します。次に、顕微鏡でイメージングシーケンスを開始します。精子細胞を高フレームレート、好ましくは毎秒10フレーム以上で撮像する。
画像取得開始から10秒後に、シングルセルデリバリーシステムを作動させ、10秒間の刺激剤を送達します。10〜15分間、細胞の画像を撮影し続けます。同様に、画面に表示されている位置に従って、1つの皿から複数のセルを画像化します。
