SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique

ホルマリン固定、パラフィン包埋脳切片をスクリュー蓋付きの皿に入れることから始めます。スイッチオフ液を皿に貼り付け、アルミホイルで覆い、摂氏4度で1日振とうしながらインキュベートします。翌日、すべてのサンプルを新しいディッシュに移し、前述のようにスイッチオン溶液でインキュベートします。

インキュベーションの最後に、サンプルをチューブに入れ、振とうしながらPBSで2時間3回洗浄します。次に、サンプルに不活化溶液を添加し、摂氏37度に設定したウォーターバスで一晩インキュベートします。3回の洗浄を行った後、サンプルに清澄液を加え、摂氏55度のウォーターバスで3〜7日間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、インキュベーターで37°CのPBSTでサンプルを3時間洗浄します。翌日、各サンプルに30%過酸化水素10ミリリットルを加え、室温で振とうしながらPBSで10分間サンプルを3回洗浄します。次に、抗原賦活化溶液をウォーターバスで摂氏95度に予熱します。

サンプルを加熱溶液に移し、摂氏95度で10分間インキュベートした後、シェーカーで室温で40分間インキュベートします。試料を脱イオン水で5分間、振とうしながら洗浄します。サンプルをPBSで平衡化します。

次に、サンプルをスクリュー蓋付きの皿に移します。ビーカーですべてのサンプルに対して新鮮な一次抗体溶液を調製した後、それをサンプルに加え、37°Cで1〜7日間、暗所で穏やかに振とうしながらインキュベートします。次に、サンプルをチューブに入れ、インキュベーター内で摂氏37度に予熱したPBSTを使用して洗浄します。

サンプルをスクリュー蓋付きの皿に移し、PBSTで調製した二次抗体と0.01%アジ化ナトリウムを加えます。サンプルをチューブに移し、予熱PBSTで37°Cで2時間振とうしながら3回洗浄します。屈折率マッチングのために、サンプルを新しいディッシュに入れ、TDEの30%溶液を加えます。

次に、サンプル中の30%TDEを68%TDE溶液に置き換え、振とうしながら室温に置いておきます。短時間の処理後、灰白質と白質の両方で、すべての組織スライスの最適で均質な透明性が達成されました。