好中球細胞外トラップ(NET)を採取するためのラット好中球単離の1ステップおよび2ステップ法

骨髄採取を開始するには、安楽死させたラットを75%エタノールに浸し、毛皮と皮膚を殺菌します。ネズミを仰向けに寝かせ、腰で下肢を切断して大腿骨の頭を保護します。解剖ハサミを使用して、ホックジョイントの靭帯を切断します。

次に、膝関節を後方に折りたたんで、大腿骨と脛骨を露出させます。鉗子とハサミを使用して、骨に接続されている筋肉、腱、その他の組織を慎重に取り除きます。5ミリメートルの針状注射器で骨の両端に骨髄を突き刺し、骨髄マトリックスを緩めます。

次に、新しいシリンジを使用して、10〜15ミリリットルのRPMI培地で骨髄を洗い流します。骨髄細胞を300Gで20°Cで10分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を5〜10ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁します。

懸濁液をインキュベートした後、混合物に4倍の容量のHBSSを加えます。その後、細胞を600Gで室温で5分間遠心分離します。得られたペレットをさらに使用してください。

まず、ラット骨髄好中球分離キットで好中球を単離します。15ミリリットルの遠心分離管に80〜55%の80-55%の試薬を2ミリリットル重ねて、密度勾配を作成します。次に、単離された好中球、またはラット骨髄好中球分離キットで単離された細胞の再懸濁液をチューブにピペットで移します。

チューブを800Gで20°Cで40分間遠心分離します。滅菌ピペットを使用して、65〜70%境界の細胞層を含む70%グラジエント層を回収します。細胞懸濁液を新しい15ミリリットルの遠心チューブに移します。

15ミリリットルのHBSSをチューブに加え、静かに反転させて内容物を混ぜます。最後に、チューブを室温で300Gで10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。ワンステッププロセスでは、骨髄懸濁液を密度勾配チューブに直接ピペッティングした後、前述のように遠心分離します。

次に、75〜70%のグラデーション境界にあるレイヤーを含む70%グラデーションレイヤーをピペットで取り出します。この細胞懸濁液を、10ミリリットルのHBSSを入れた新しい50ミリリットルの遠心チューブに移します。次に、チューブを400Gで室温で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。

単離された好中球を血球計算盤でカウントし、トリパンブルー染色で細胞の生存率を評価します。2 ステップ法では、1 ステップ法で達成された 50% と比較して、90% の純度レベルが向上しました。