ラット好中球細胞外トラップ(NET)の獲得と検証

まず、単離したラット好中球を、無菌の10センチメートルペトリ皿に添加した4ミリリットルのRPMI培地に再懸濁します。次に、好中球懸濁液に4マイクロリットルのPMAを加えて、NETの形成を誘発します。混合物を摂氏37度で5%の二酸化炭素下で3時間インキュベートします。

ネガティブコントロールでは、好中球懸濁液に4〜5マイクロリットルのDNASE1を添加して、分泌されたNETを分解します。次に、4ミリリットルのHBSSを加えてNETを洗浄します。各プレートに4ミリリットルの新鮮な培地をプレートで洗い流し、NETを取り外します。

次に、洗浄媒体を新しいチューブに集め、頻繁にピペットで操作して、NETを完全に再懸濁します。懸濁液を300gで20°Cで10分間遠心分離し、浮遊細胞を除去します。次に、NETを含む上清培地を新しいチューブに回収します。

NETと浮遊細胞の懸濁液を、浮遊細胞を沈殿させるために、1.4センチメートルのガラスカバースリップを入れた24ウェルプレートで遠心分離します。次に、カバースリップ上のセルを4%PFAで固定し、NETの存在の確認に進みます。次に、パラフィンフィルムで覆われた試験管スタンドにHBSSを一滴置きます。

カバースリップをHBSS液滴に裏返して洗浄します。洗浄後、細胞を250マイクロリットルの0.5x Triton X-100で室温で10分間インキュベートし、透過処理します。次に、細胞をHBSSで1分間3回洗浄します。

細胞を室温で10%通常のロバ血清に1時間密封します。最後に、70〜90マイクロリットルの抗ラット抗体と細胞を摂氏4度で一晩インキュベートします。カバースリップをHBSSで5分間ずつ3回洗います。

次に、カバースリップを二次抗体中で室温で暗所で1時間インキュベートしてから、HBSSを洗浄します。細胞核とNETの骨格を70〜90マイクロリットルのDAPIで染色します。HBSS洗浄を各5分間、3回行います。