ラット好中球細胞外トラップ(NET)の蛍光定量およびサイトメトリー解析

まず、50マイクロリットルの単離ラットNETサンプルを450マイクロリットルのTris-EDTA緩衝液の入ったチューブにピペットで移します。次に、100マイクロリットルのDNA標準試料とサンプルを96ウェルプレートにピペットで移します。同量のアッセイ試薬をウェルに添加します。

次に、プレートを室温で2〜5分間インキュベートし、直射日光にさらさないようにします。プレートを蛍光マイクロプレートリーダーに入れます。発光スペクトルを約530ナノメートル、吸収スペクトルを約480ナノメートルに設定します。

細胞を1マイクロリットルの核染色液中で30分間インキュベートします。次に、細胞を1マイクロリットルの無細胞DNA株で10分間インキュベートします。蛍光染料を静かに混ぜます。

サンプルプレートをサイトメーターにロードします。SYTOX Green チャンネルに切り替えて、HEXT チャンネルを選択します。照明を青 377/447 に設定し、露光時間を 300, 000 マイクロ秒に調整します。

[フォーカス設定]をクリックし、[自動登録]をクリックしてフォーカスを自動的に調整します。SYTOX Greenチャンネルを選択し、イルミネーションをGreen 483/536に設定します。SYTOX Green の露光時間を 30, 000 マイクロ秒に設定します。

[スキャンの開始]をクリックして、スキャンプロセスを開始します。末梢好中球と骨髄好中球の間では、PMA刺激に関係なく、NET分泌における同等の反応が認められました。.また、ラットNETは、互いに限られた架橋能力を示しました。

PMAとのインキュベートでは、4時間後に無細胞DNA含量が10%増加し、NET形成を誘発する傾向が高いことが示されました。