ヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の解離と最適な凍結保存段階の決定

まず、解凍した冷たい基底膜マトリックスのバイアルを12ミリリットルのDM EM F12で希釈します。サスペンションをよく混ぜます。24ウェルプレートの各ウェルにカバースリップを1枚追加します。

次に、250マイクロリットルの希薄マトリックス溶液を各ウェルにピペットで移します。培養したhESC由来の網膜色素上皮細胞プレートの培地を廃棄する。ウェルごとに1ミリリットルの予熱されたPBSでプレートを2回洗浄します。

次に、培養プレートのウェルに0.5ミリリットルの細胞解離試薬を加え、摂氏37度で15分間インキュベートして消化を開始します。インキュベーション後、顕微鏡で細胞を観察し、消化の終了を確認します。1ミリリットルのピペットで、細胞懸濁液を10回上下に静かにピペットします。

予熱した培地を加えて、懸濁液を希釈します。その後、室温で250Gで3分間遠心分離します。遠心分離管から上清を注ぎます。

次に、細胞ペレットを2ミリリットルの培地に再懸濁します。ピペットを使用して細胞を10〜15回混合します。細胞懸濁液を40μmのセルストレーナーでろ過します。

次に、網膜色素上皮細胞を数えます。めっきする前にコーティング溶液を吸引してください。次に、各ウェルに1ミリリットルの培地を加え、カバースリップに細胞を播種します。

EDUの取り込みと染色後、蛍光顕微鏡で5つのランダムフィールドの画像を撮影します。EDU陽性細胞の割合を計算します。次に、対応する比率時間曲線をプロットして、成長曲線を生成します。

最後に、各細胞株の指数関数的段階からの凍結ウィンドウを決定します。網膜色素上皮細胞は、当初、その特徴的な六角形の形態を失ったが、後に成長の指数関数的段階でそれを取り戻した。細胞をさらに1週間培養すると、細胞増殖は減少しました。

EDU増殖アッセイにより、P2 day 5細胞はより高い増殖速度を示し、P2 day 11細胞は減速段階に入ったことが確認されました。