まず、細胞培養インサートを24ウェル組織培養アダプタープレートに入れます。インサートの頂端側を、100マイクロリットルの基底膜細胞外マトリックスまたはBMEでエンテロイド増殖培地にプレコートします。バリアの完全性測定中にコントロールとして使用するために、追加のインサートをコーティングします。
次に、コーティングしたインサートを摂氏37度、5%二酸化炭素で1時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、3Dエンテロイド培養液を吸引します。ウシ回腸エンテロイドを1ミリリットルの氷冷洗浄培地で採取します。
セルスクレーパーを使用してドームを取り外し、15ミリリットルの円錐形のチューブに集めます。1ミリリットルのピペットチップで、30回トリチュレートしてエンテロイド断片を生成します。次に、200マイクロリットルのピペットチップを使用してさらに約40回トリチュレーションし、エンテロイド断片を分解します。
チューブの容量を氷冷洗浄剤で10ミリリットルに増やします。次に、チューブを室温で300gで5分間遠心分離します。BME層を含む上清を慎重に吸引します。
次に、4つのドームごとに、ペレットを1ミリリットルの予熱したTrypLE発現酵素に再懸濁します。混合物を24ウェルプレートに移し、5%二酸化炭素下で摂氏37度で10分間インキュベートします。混合物を1ミリリットルのピペットで静かにピペットでピペットし、エンテロイドをさらに分解します。
次に、混合物を200マイクロリットルのピペットでピペット処理し、断片を単一細胞に分解します。滅菌済みの22ゲージ針を装着した3ミリリットルのシリンジを使用して、細胞懸濁液を4回吸引および分注し、単一の細胞懸濁液を実現します。顕微鏡で、エンテロイドの80%が単一細胞に分解されるまで細胞の解離を観察します。
次に、細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに集めます。4容量のFBS洗浄培地を添加して反応をクエンチします。次に、エンテロイドをプレコートされた40マイクロメートルのセルストレーナーで2回ろ過し、50ミリリットルのコニカルチューブに入れます。
懸濁液を300gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を解離したウシ回腸内細胞懸濁液の遠心チューブに吸引します。ペレットを少量のオルガノイド増殖培地に再懸濁します。
次に、トリパンブルー色素排除法と血球計算盤を使用して、細胞生存率を測定します。細胞培養インサートから余分なコーティング液を慎重に取り除きます。200マイクロリットルの単一細胞懸濁液を、コーティング済み培養インサートの頂端表面に播種します。
次に、700マイクロリットルのFBS完全培地をインサートの基底側側面に追加します。プレートを数字の8の形に約10回動かして、セルをインサート全体に均等に分散させます。次に、プレートをバイオセーフティキャビネットのプレートウォーマーに10分間置きます。
プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素、48時間インキュベートします。インキュベーション後、頂端および基底成分の培地を新しい腸内増殖培地と交換します。翌日、頂端および基底側コンパートメントから培地を取り除きます。
インサートをPBSで慎重に洗浄し、阻害剤のみを添加したエンテロイド分化培地と交換します。腸内圏の形成は、メッキされたウシ陰窩の培養から数時間後に観察されました。2日後、球体の内腔は明確に定義され、4日目には発芽した構造が観察されました。
成熟したエントロイドは7日目までに観察された。7日齢の3Dエンテロイドの免疫染色により、異なる細胞系統の存在が示されました。E-カドヘリンタンパク質は接着接合部に局在していた。
エンテロイドは、腸内分泌細胞およびリゾチーム産生パネート細胞に対して陽性であった。コンフルエントな2D単層は、培養後1週間未満で観察されました。
