まず、解剖したハマダラカの頭をCCDバッファーで37°Cのヒートブロックで5分間予熱します。蚊の頭が入ったチューブをハイブリダイゼーションオーブンに移し、摂氏37度で回転させます。次に、チューブの内容物全体を解剖時計ガラスに移します。
鉗子を使用して、頭または取り外したアンテナを拾い上げ、1ミリリットルの予備固定剤で固定します。分桜を握り、前固定液中のヘッドを摂氏4度で24時間回転させます。組織解剖を行うには、まず、氷上で1ミリリットルの0.1%PBS-Tweenで頭をすすぎます。
次に、頭を解剖時計ガラスに移します。解剖顕微鏡の下で、鋭利な鉗子で頭部から目的の組織を取り除きます。鉗子で頭部の前部を持ち、基部から別の鉗子でアンテナをつかみます。
同様に、触覚を取り除きます。触角と触覚を、氷上に置いた空のDNA/RNAフリーチューブに移します。400マイクロリットルの脱水試薬で室温で1時間組織を脱水します。
次に、脱水試薬を400マイクロリットルの無水メタノールと交換し、摂氏マイナス20度で一晩組織を脱水します。固定が完了したら、氷上で10分間、段階的な再水和溶液の4ステップシリーズで組織を再水和します。次に、400マイクロリットルのPBSTで組織を室温で10分間洗浄します。
400マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液中で、室温で30分間組織をインキュベートします。400マイクロリットルのPBSTで組織を2回洗浄し、酵素消化を停止します。ポスト固定剤を添加した後、プローブハイブリダイゼーションの前に、組織をPBSTで再度洗浄します。
組織を400マイクロリットルのプローブハイブリダイゼーションバッファーに5分間浸します。次に、緩衝液を除去し、400マイクロリットルの予熱したプローブハイブリダイゼーション緩衝液中で組織を摂氏37度で30分間プレハイブリダイズする。予熱したプローブハイブリダイゼーションバッファーを400マイクロリットルの加熱プローブ溶液と交換します。
チューブを37°Cで2晩、乳桜に入れます。次に、箱で覆われたインキュベーターの中にニューテーターを置きます。次に、インキュベーター内で摂氏37度で400マイクロリットルのプローブ洗浄バッファーで組織をニューテーションします。
5x SSCTで組織を洗浄した後、400マイクロリットルの増幅バッファー中で室温で10分間インキュベートします。チューブから増幅バッファーをピペットで取り出します。次に、加熱したヘアピンH1とH2の混合物を追加します。次に、100マイクロリットルの増幅バッファーをピペットで移す。
室温で暗所で一晩組織をニューテーションします。組織を埋入するには、まずスライドガラスに封入液を5滴垂らします。次に、鉗子を使用して、洗浄した組織サンプルのベースをつかみます。
一連の封入液滴に静かに浸し、すすぎます。次に、封入液で取り付け、組織の上にカバースリップを置きます。イメージングする前に、カバースリップをマニキュアで密封してください。
雌のハマダラカの嗅覚組織のHCRフィッシュ分析により、IR 41t1、IR75d、およびIR7tが触角にあまり存在していないことが明らかになりました。IR64aは、他の候補遺伝子よりも3倍豊富でした。オルコ受容体ファミリーとIR25a受容体ファミリーの共局在は、蚊の上顎触手だけでなく、触角でも観察されました。
共局在パターンは、IR76b陽性細胞がIR25aを発現するのに対し、IR8a陽性細胞はIR76bおよびIR25aと部分的に共局在することを示唆しています。
