まず、500マイクロリットルの温かい培養ゲルを24ウェルプレートのウェルに加えます。マウスから分離された切開した切歯全体をウェルにすばやく移します。プレートを数回回転させて切歯をすすぎます。
400マイクロリットルの温かい培養ゲルを培養皿に加え、すすいだ切歯を皿に移します。切歯を傾けて頸椎ループ領域を皿の中心に配置し、頂端切歯の傾きを目的のイメージング面に調整します。ゲルが固まったら、一対の細かい鉗子を使用して、関心領域の上にあるゲルを取り除きます。
約150マイクロリットルの温かい培地を皿の端に加え、サンプルを覆います。外植片培養液を摂氏37度に置き、組織を沈降させます。1時間後、顕微鏡と2光子レーザーの電源を入れます。
培養皿をステージアダプターに固定し、プロフュージョンアダプターリングを上に置きます。ステージアダプターを温度調節器に接続し、培養を摂氏37度に保ちます。アダプターリングの入口と出口をマイクロプロフュージョンポンプに接続します。
拡散速度を 20 に設定し、サンプル上で培地の拡散を開始します。アダプターリングの上にACBRを置き、対物レンズがACBRに収まるようにステージを持ち上げて培地と接触させます。レーザーの波長を920ナノメートルにしてGFPを可視化します。
接眼レンズを通してサンプルの位置を特定した後、顕微鏡ソフトウェアで可視化し、4マイクロメートルのZステップサイズと5分の時間間隔を14時間設定します。タイムラプスイメージングを開始し、ダウンストリームデータ分析のために後続のファイルを保存します。K14-Creのタイムラプス顕微鏡。R26-rtTA;tetO-H2B-GFP子宮頸管ループでは、H2B-GFPシグナルは主に子宮頸管ループのトランス増幅領域で観察され、活発な細胞分裂を示しました。
さらに、有糸分裂細胞の中期プレートでの染色体の凝縮と整列、続いて後期および2つの娘細胞への分離が観察されました。ほとんどの細胞分裂は、基底膜に対して垂直または斜めの角度で行われ、基底膜に平行な水平分裂は少なかった。細胞分裂イベントはK14-Creでも明らかでした。R26-mT/mG子宮頸管ループで、すべての上皮細胞膜が緑色にラベル付けされました。
有糸分裂細胞は、細胞の丸めとその後の細胞質分裂によって同定されました。In K14-Cre;R26-mT/mG子宮頸管ループ、水平および垂直の両方の細胞分裂も観察されました。
