まず、8ミリリットルのDPBSを滅菌済みの50ミリリットルのコニカルチューブに入れます。これに8ミリリットルの血液を加え、3ミリリットルのプラスチック製のパスツールピペットを使用して内容物をよく混ぜます。15ミリリットルのリンパ球分離培地を別のコニカルチューブに加えます。
チューブを20〜30度傾けます。次に、3 mmリットルのパスツールピペットを使用して、血液DPBSミックスの最初の層を分離培地に穏やかに塗布します。残りの混合物をチューブの側壁に注意深く重ねます。
チューブをゆっくりと直立させて、残りの血液を血液層に重ねます。ブレーキをオフにした状態で、チューブを1000Gで室温で10分間遠心分離します。血中PBMCミックスは4つの異なる層に分離します。
パスツールピペットで血漿層の3分の2を取り除き、1ミリリットルのピペットでPBMCを回収し、層全体が回収されるまでPBMCを新しい50ミリリットルチューブに移します。次に、DPBSで容量を25ミリリットルまで増やして、残留分離培地やその他の残留物を除去します。
ブレーキをかけた状態で、チューブを100Gで室温で10分間遠心分離します。その後、真空ポンプで上澄みを取り除きます。次に、ペレットを1ミリリットルのDPBSに再懸濁し、さらにDPBSを加えて容量を25ミリリットルに増やし、ペレットを洗浄して再懸濁します。
冷凍容器を摂氏4度に冷却します。次に、ウシ胎児血清を氷の上に置きます。単離されたPBMCを含む細胞ペレットを1ミリリットルのウシ胎児血清に再懸濁します。
次に、氷上で冷却した血清とDMSOを1対5の比率で混合します。細胞懸濁液を2ミリリットルの標識クライオチューブに移し、1本のコレクションチューブにつき1本のチューブを使用します。自動セルカウンターを使用して、細胞数と生存率を決定します。
1ミリリットルのピペットを使用して、1ミリリットルのDMSOFBS混合物をチューブに滴下します。次に、チューブを予冷した冷凍容器に入れます。容器をマイナス80°Cの冷凍庫に24時間入れます。
翌日、チューブを冷凍庫から取り出し、液体窒素の気相に保管します。凍結保存の前後で細胞数と生存率は一貫しており、単離と保存が成功したことが示されました。
