まず、鉗子を使用して、安楽死させたマウスの解剖された顎下唾液腺から脂肪組織と結合組織を取り除きます。次に、グランドを氷冷HBSS溶液の入ったコレクションチューブに入れます。次に、鉗子を使って腺を1センチ四方に切ります。
4%アガロースを50°Cに加熱し、35mmの皿に注ぐ。少量のアガロース溶液を別の皿に注ぎ、腺片を加えます。次に、余分なアガロースでピースを渦巻かせてコーティングします。
次に、腺の4〜6個をアガロースで最初の皿に平らに置きます。皿に蓋をしてアイスボックスに移し、皿を氷で覆って冷まして固めます。腺片を切片にするには、まずメスを使って腺に埋め込まれたアガロースブロックの周りを慎重に切断します。
次に、アガロースブロックに瞬間接着剤を一滴垂らし、ビブラトームのステージに取り付けます。次に、ビブラトームチャンバーを1%ペニシリンストレプトマイシンを含む氷冷PBSで満たします。メスで余分なアガロースを切り取り、各腺の間に5ミリメートルの隙間を作ります。
ビブラトームブレードをアガロースブロックに合わせ、切片の始点と終点を設定します。組織ブロックを150マイクロメートルの厚さのセクションに低速および高振動で切断します。切片を切ったら、絵筆を使ってスライスを拾い上げ、抗生物質を含む予熱したRPMI培地を入れた皿に入れます。
顎下スライスを培養するには、まず、1.5ミリリットルのRPMI培地を6ウェルプレートのウェルに加えます。0.4マイクロメートルのフィルターをウェルに入れます。次に、絵筆の助けを借りて、各フィルターに1〜6枚のスライスを慎重に移します。
次に、プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素でインキュベートします。実験用プレートにガンマ線を照射して傷害を誘発した後、プレートをインキュベーターに戻します。次に、24ウェルプレートのウェルに500マイクロリットルの培地を充填します。
絵筆で、フィルターからスライスを持ち上げ、ウェルにそっと沈めます。スライスを関連する核染色でインキュベートします。次に、スライスを抗体とともに、穏やかに撹拌しながら摂氏37度で2時間インキュベートします。
スライスを培地に3回浸して洗浄します。スライスを各洗浄液中で室温で10分間、穏やかに撹拌しながらインキュベートします。次に、鉗子を使用して、両面イメージングスペーサーからテープをはがします。
スペーサーをガラス底の6ウェルプレートの底に貼り付け、スペーサーの中央の隙間に50マイクロリットルの培地をピペットで移します。スライスをメディアに入れ、平らになるようにします。次に、ピペットで、ギャップから20マイクロリットルの培地を慎重に取り除きます。
鉗子を使用してスペーサーの上面からテープを慎重にはがし、その上に25mmの円形のカバースリップを置きます。スペーサーの端を押して、カバースリップがしっかりと取り付けられるようにします。共焦点顕微鏡でスライスを画像化します。
7日間培養した顎下腺の非照射スライスは、MTシグナルと上皮構造を保持しました。しかし、照射後3日目には腺房細胞と乳管細胞の萎縮が認められました。カスパーゼ陽性細胞は照射後4日目に見られた。
照射された切片ではガンマH2AXの上昇が観察され、in vivoでのDNA損傷が示唆された。マクロファージのリアルタイムイメージングにより、スライス培養モデルで上皮細胞の貪食が確認されました。個々の細胞を検出してセグメント化し、遊走などの細胞挙動を解析することができます。
