まず、L3期のショウジョウバエ幼虫を冷たいPBSでそれぞれ5分間3回すすぎます。2対の鋭い鉗子を使用して、幼虫の前部を保持し、体組織の約2/3を取り除きます。幼虫の最初の1/3を1対の鉗子で保持し、もう1対の口フックで保持します。
次に、幼虫が完全に反転するまで、幼虫の内側の口フックを引っ込めます。脚椎間板と脳を取り除き、気管に一対の翼椎間板が取り付けられたきれいな倒立幼虫の死骸を取得します。ウィングディスクを1ミリリットルの遠心チューブに移します。
PBSで希釈した4%パラホルムアルデヒドで室温で45分間撹拌しながら翼ディスクを固定します。固定後、サンプルを70%エタノールで5分間ずつ3回洗浄します。麻酔をかけたハエから頭部、腹部、脚、翼を取り除き、解剖した胸部を冷たいPBSに入れます。
1%Tritonで希釈した4%パラホルムアルデヒドを胸部にプレフィクスし、攪拌下で20分間投与します。次に、撹拌下でPBTを使用してサンプルを3回、それぞれ5分間洗浄します。胸部をスライドガラスの両面テープ上に配置し、鋭利なミクロトームブレードを使用して胸部を二等分し、2つの半胞体を作成します。
攪拌下で45分間、4%パラホルムアルデヒドにヘミソレースを固定します。撹拌下でPBTを使用して、サンプルをそれぞれ20分間2回洗浄します。半信筋を冷たいPBSに入れ、鉗子を使用して半信走から間接飛行筋を慎重に分離します。
70%エタノールで摂氏4度で2〜7日間筋肉を透過させます。透過処理の後で、緩衝A.Thenを使用して20分のそれぞれのためのIFMsを2回洗浄し、ハイブリダイゼーション緩衝の400マイクロリットルを加え、熱ミキサーの37の摂氏温度で30分間筋肉を前交配させる。プローブと一次抗体を含む新たに調製したハイブリダイゼーションバッファーを100マイクロリットル加えます。
サンプルをサーマルミキサーで摂氏37度、300RPMで16時間インキュベートします。インキュベーション後、温かいバッファーAを使用してサンプルを3回、それぞれ10分間洗浄します。次に、サンプルを二次抗体およびDAPIで希釈し、バッファーAで37°Cで1時間インキュベートします。
サンプルをバッファーBで20分間ずつ3回洗浄してから、顕微鏡スライドに移します。残留バッファーBを拭き取り、30マイクロリットルの封入剤をスライドに加えます。18 x 18 mmのカバースリップをスライドに置き、マニキュアでカバースリップを密封します。
