40倍と63倍の油浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡の電源を入れた後、スライドを顕微鏡ステージに置きます。翼板に関連する前駆筋と間接飛行筋(IFM)を画像化するには、DAPIを励起405、発光450ナノメートルに設定します。次に、励起波長496、発光波長519ナノメートルのAlexa Fluor 488を、励起波長647、発光波長670ナノメートルのsmFISHプローブ用Quasar 670を選択します。
DAPI信号とUVランプを使用してサンプルの位置を特定します。キャプチャした画像をTIFFファイルとして保存します。成体筋幹細胞を画像化するには、前述のようにDAPIおよびAlexa Fluor 488の励起波長と発光波長を設定します。
次に、Alexa Fluor 555 と Quasar 670 の smFISH プローブの波長を設定します。サンプルを見つけて、キャプチャした画像を TIFF として保存します。画像 J を起動し、プラグイン メニューに移動します。
[マクロ] を選択し、次に [編集] を選択して、マクロのソース コードを開きます。幼虫の Mef2 smFISH スポットを定量化するには、対数半径を 3 に、対数品質を 20 に設定します。次に、ぼかしが 2、核スケール パラメーターが 30、核の閾値がマイナス 8、核のサイズが 300 の Mef2 陽性核をセグメント化します。
run コマンドを実行してマクロを開始します。マクロは、指定されたフォルダーからすべての画像を自動的に読み込み、それらを順番に定量化します。筋線維では、対数半径を 2.5 に、対数品質を 60 に、ぼかしを 2 に、核スケール パラメータを 100 に、核のしきい値を 0 に、核のサイズを 300 に設定します。
run コマンドを実行してマクロを開始します。マクロは、指定されたフォルダーからすべての画像を自動的に読み込み、それらを順番に定量化します。解析後、ファイルFISH結果とファイル原子核結果に表示される結果を確認します。
Mef2およびZfh1転写産物はAMP集団において均一に検出され、それぞれMef2およびZfh1タンパク質と共局在した。AMPの倍率が高いほど、転写部位の焦点と細胞質に散在する成熟mRNAが区別されました。同様に、Mef2およびZfh1 mRNAの転写部位および分布を、分化した成体IFMおよび関連幹細胞で調べました。
社内で構築された画像Jマクロは、Mef2スポットと筋肉核を効果的に検出し、セグメント化しました。成人のIFMとAMPの核あたりのMef2 mRNAの定量分析では、有意差はありませんでした。Mef2スポット分布の定量化により、Mef2 mRNAの92%が細胞質に存在し、8%が筋肉核と関連していることが示されました。
