Tissue Embedding and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

まず、マウスの心臓から左心房と肺静脈またはPVを分離します。単離した組織を、心臓の基部と肺の頂点を上に向けてクライオモールドに入れます。PVが複雑になっている場合に備えて、PVのねじれをほどき、もつれを解きほぐします。

次に、クライオモールドにOCTコンパウンドを充填します。細かい鉗子を使用して、PVを動かさずに穏やかに圧迫し、残留空気を取り除きます。OCT化合物の組織をドライアイスで凍結します。

免疫染色では、凍結マウスPVスライドを染色システム上で20分間解凍します。次に、4%パラホルムアルデヒド固定溶液を切片に数滴投与し、組織をスライドに固定します。インキュベーション後、スライドを垂直ラックに移し、PBSで満たされた容器に沈めます。

容器をスローシェーカーに5分間置き、スライドをすすぎます。キシロールを含む液体ブロッカーペンを使用して、すべてのスライドの各セクションを囲みます。そして、染色システムのスライドを再編成します。

パスツールピペットを使用して、各サンプルに透過処理溶液を1〜2滴滴塗布します。次に、スライドをPBSで5分間洗浄して、Triton X-100溶液を洗浄します。染色システム上でスライドを再配置した後、各切片にブロッキングバッファーを1〜2滴添加し、完全にカバーするようにします。

次に、一次抗体とブロッキングバッファーからなる一次抗体混合物1ミリリットルを調製します。スライドから残ったブロッキングバッファを破棄します。一次抗体混合物を各切片に2〜3滴投与します。

インキュベーション後、スライドを垂直ラックに置き、穏やかな撹拌を維持しながら、スライドを洗浄バッファーで5分間すすぎます。次に、二次抗体と洗浄緩衝液からなる二次抗体混合物1ミリリットルを調製する。スライドを染色システム上で再配置し、ピペットを使用して二次抗体ブレンド液を各切片に2〜3滴分注します。

続いて、振とうしながら、スライドを洗浄バッファー中でそれぞれ5分間、3回洗浄します。次に、Hoechst 33342溶液を染色システム上に配置した各切片に2〜3滴加えます。スライドを垂直ラックに置き、穏やかに攪拌しながら洗浄バッファーで5分間すすぎます。

各スライドに蛍光封入剤を1滴または2滴加え、スライドをカバースリップで密封します。左心房の肺静脈オリフィス領域と肺静脈接合部、肺外静脈、肺間静脈を10倍の倍率で観察した。肺静脈オリフィス、肺外静脈、および肺内静脈に典型的な筋条線を伴う特異的なcTnTシグナルが40倍の倍率で観察されました。

Cx43は3つの肺領域すべてに見られ、主に隣接する心筋細胞間に投射されました。Cx43関連のシグナルは、心筋スリーブの心筋細胞の極側と外側で観察されました。