Trichogramma dendrolimiの蛹へのdsRNAのマイクロ注入と発生転帰のモニタリング

まず、ガラスの針引き機をオンにしてから、熱を280、速度を170、遅延を250、ポールを30に設定します。キャピラリーガラス針の先端を面取りします。次に、マイクロインジェクションポンプを使用して、約2マイクロリットルのフェリチン重鎖相同性二本鎖RNA溶液を注射針にロードします。

Trichogramma dendrolimi 蛹を含む寒天プレートを複合顕微鏡ステージに移します。注射針を蛹の腹部に約30度の角度で慎重に挿入し、5ナノリットルのフェリチン重鎖相同性二本鎖RNA溶液を徐々に注入します。処理ごとに約700匹の蛹を摂氏25度で24時間または48時間インキュベートします。

1回の繰り返しで100匹の蛹からRNA含量を抽出します。1回の治療で約50匹の蛹から、スズメバチの羽化を観察します。最後に、スズメバチの出現率と変形率を記録します。

二本鎖フェリチン重鎖相同性を注入したT.dendrolimi蛹は、二本鎖GFPまたは注射なしで注入された蛹と比較して、有意に低い出現率を示しました。羽化したスズメバチでは、二本鎖フェリチン重鎖相同性スズメバチの51.85%が変形した小翅を発達させた。この変形は、二本鎖GFPを注入したスズメバチや注入していないスズメバチには見られませんでした。

さらに、二本鎖フェリチン重鎖相同性を注入したT.dendrolimiの蛹は、鉄代謝異常を示すメラニズムを示しました。メラニンは、二本鎖GFPを注射したスズメバチや注射を打たなかったスズメバチでは観察されませんでした。