Western Blot Analyses of FAM83A Knocked Down Human Cervical Cancer Cells

上記で処理した細胞を氷冷PBSで洗浄して残留培地を除去し、PMSFを含むRIPA溶解バッファーを50マイクロリットル添加して細胞を溶解します。細胞をチューブに集めます。氷上で数分間細胞をインキュベートして完全な溶解を確保し、摂氏4度、12, 000 gで15分間遠心分離します。

次に、細胞溶解物をローディングバッファーと混合し、混合物を摂氏95〜100度でウォーターバスで5〜10分間加熱してタンパク質を変性させます。各サンプルから10マイクロリットルの総タンパク質をSDS0-PAGEゲルにロードします。ゲルを80ボルトの定電圧で泳動させます。

ブロモフェノールブルーが分離ゲルの底に達したら、電気泳動を停止します。次に、氷浴で湿式転写システムを使用して、分離したタンパク質をゲルからポリフッ化ビニリデンメンブレンに転写します。転写完了後、メンブレンを除去し、メンブレンをブロッキングバッファー中で室温で約1時間インキュベートします。

HRPに結合した二次抗体とメンブレンをインキュベートします。化学発光基質を用いてメンブレン上のタンパク質バンドを可視化し、化学発光イメージングシステムを用いてシグナルを捕捉します。ウェスタンブロット解析では、FAM83Aの発現を抑制すると、Baxおよび切断カスパーゼ-3タンパク質が増加し、BCL-2の発現が減少し、シトクロムcの放出が増加することが示されました。