まず、PFFを注入したC57ブラックシックスマウスのパラフィン脳切片を採取します。スライドをキシレン代替品に浸し、2分間インキュベートして脱ワックスします。水分補給のために、スライドを100%95%と70%のエタノールに浸し、次に脱イオン水に2回浸します。
サンプルを二重蒸留水と一緒に電子レンジ対応容器に移します。pH 6 の 100 倍クエン酸緩衝液を摂氏 4 度で温めます。次に、350ミリリットルの新鮮なクエン酸緩衝液を調製します。
準備したクエン酸緩衝液を蓋付きのプラスチック容器に注ぎます。スライドをクエン酸緩衝容器に入れ、蓋をしっかり閉めます。サンプルを700ワットで4分間電子レンジで加熱し、その後5分間休ませます。
さらに1.5分間電子レンジで加熱し、続いて5分間の休止期間を設けて、クエン酸緩衝液を補充します。電子レンジで1.5分加熱し、5分間休ませます。次に、サンプルとクエン酸緩衝液を氷上で20分間冷却し、二重蒸留水で洗浄します。
ティッシュに触れずにペーパータオルを使用してサンプルスライドを乾燥させます。パップペンを使用して、ティッシュの断片の周りに長方形を描きます。次に、すべてのスライドをスライド免疫染色ボックスに移します。
TBS-Tで何度もやさしく洗い、TBS-Tの滴がPAPペンの長方形内に収まるようにします。ペーパータオルのスライドをタップして、TBS-Tを取り除きます。各長方形に50マイクロリットルのブロッキングを加え、室温で1時間インキュベートします。
インキュベーションの最後に、ペーパータオルを使用して、サンプルからブロッキング溶液を取り除きます。50マイクロリットルの一次抗体混合物とTBS-Tを各長方形に静かにピペットで移し、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、スライドをTBS-Tで洗浄します。
ペーパータオルをタップしてTBS-Tを取り外します。このプロセスを 3 回繰り返します。次に、TBS-Tで1〜1000希釈した50マイクロリットルの二次抗体混合物を各長方形に加え、暗所で摂氏37度で1時間インキュベートします。
その後、TBS-Tでサンプルを3回洗浄します。次に、サンプルをTBS-T中で1ミリリットルあたり2マイクログラムの濃度でDAPIと1分間インキュベートします。ペーパータオルを叩いてDAPI溶液を取り除き、TBS-Tで3回洗います。
ガラスカバースリップを埋込するには、埋込試薬のスライドごとに2滴をサンプルに加えます。カバースリップを軽く押して気泡を除去し、サンプルを室温で1時間乾燥させます。60倍オイル対物レンズまたは共焦点技術を備えた構造化照明蛍光イメージングシステムを使用して、さまざまな分野の少なくとも50個の細胞をイメージングします。
細胞を分析するには、正または負のセルの周囲に等高線を描き、関数 crop を使用して関心領域を分離します。次に、測定設定関数で形状記述子としきい値制限オプションをアクティブにします。調整メニューでしきい値機能を選択して、しきい値レベルを調整します。
最後に、粒子の分析ツールを使用して、ミトコンドリアを捕捉するための適切なサイズを設定します。例えば、サイズを25無限大に設定し、ピクセル単位をアクティブにして、マスクの表示を選択します」チロシンヒドロキシラーゼVDAC1、PS129α-シヌクレイン、およびDAPIで染色されたPFF注入マウスのコアミノ染色された実質的な黒質粒子が示されています。抗PS129α-シヌクレイン染色により、PS129病変を有する細胞と健常細胞を区別することができました。
チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンのVDAC1染色の画像解析により、PS129病変を有するニューロンとPS129病変を欠くニューロンの間で、ミトコンドリア数とアスペクト比の両方が減少することが明らかになりました。
