Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

まず、0.4ミクロンのフィルターを備えたインサートを含む24ウェルプレートを選択します。ピペットを使用して、フィルターインサートの上下に500マイクロリットルのHBSSを追加します。次に、マルチウェルプレートを閉じ、インキュベーターに2時間入れます。

インキュベーション後、プレートからHBSSを慎重に吸引します。無細胞コラーゲン溶液を無細胞の50ミリリットルチューブに入れ、氷上のDMEMで調製します。メンブレンフィルターの上に250マイクロリットルのコラーゲンを加え、プレートに蓋をします。

溶液を室温で重合させます。次に、L-929線維芽細胞培養液をインキュベーターから取り出します。予熱したトリプシンEDTA溶液2ミリリットルをフラスコに加え、インキュベーターに3〜5分間入れます。

細胞懸濁液を滅菌済みの15ミリリットルチューブに移し、645Gで5分間遠心分離します。真空ポンプを使用して上清を吸引し、ペレットを1ミリリットルのDMEMに再懸濁します。20マイクロリットルのトリパンブルー溶液が入ったチューブに20マイクロリットルの細胞懸濁液を加えます。

また、細胞計数室を使用して細胞密度を評価します。次に、U-937単球培養液をインキュベーターから取り出します。細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのRPMIに再懸濁します。

細胞が均一に懸濁されていることを確認した後、細胞計数チャンバーを使用して細胞を計数します。次に、50マイクロリットルのDMEMにそれぞれ50, 000個のL-929細胞および15, 000個のU-937細胞を含む細胞懸濁液を調製する。各50マイクロリットルの細胞懸濁液を450マイクロリットルのコラーゲンに加え、完全に混合します。

事前にコード化された無細胞固有層を500マイクロリットルのコラーゲン細胞溶液と重ね合わせます。プレートを閉じ、インキュベーターに2時間入れて溶液を固まらせます。次に、Caco-2細胞培養液をインキュベーターから取り出します。

真空ポンプを使用して培地を吸引し、10ミリリットルのPBSで細胞をすすぎます。5ミリリットルのPBSトリプシンEDTA溶液を加え、インキュベーターに5〜8分間入れます。次に、細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのDMEMに再懸濁します。

計数後、50マイクロリットルのDMEM中に150, 000個のCaco-2細胞を含む細胞懸濁液を調製する。プレートを層流フードに10分間入れてから、インキュベーターに移します。30分後、再構築モデルの上に500マイクロリットルのDMEMを、フィルターの下に500マイクロリットルを加え、プレートをインキュベーターに戻します。

翌日、培地をフィルターの上下にそれぞれ500マイクロリットルの新鮮なDMEMと慎重に交換します。