まず、RT-qPCR 用の 2X バッファーを DNase/RNase フリーウォーターで調製します。バッファーは、さらに使用するまで摂氏マイナス 20 度で保管してください。次に、プライマーとプローブを1.5ミリリットルのチューブで混合します。
溶出バッファーで容量を補います。次に、チューブを摂氏マイナス20度で保管します。TaqポリメラーゼとM-MLV RTを氷上で1.5ミリリットルのチューブに入れた酵素ミックスを調製します。
Taqポリメラーゼ保存バッファーで容量を補います。次に、100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーを含む別々のチューブにウイルス合成RNAを再懸濁して、マイクロリットルあたり10〜6番目のRNAコピーのストックを作成します。ウイルスストックを混合するには、SARS-CoV-2インフルエンザAおよびBをそれぞれ5マイクロリットルずつ、50マイクロリットルのTris-EDTA緩衝液に加えます。
同様に、SARS-CoV-2とMERS-CoVを混合して、2番目のウイルス混合物を取得します。両方の混合物を10倍に希釈して、マイクロリットルあたり10個のRNAコピーの最終希釈液を得ます。96ウェルプレートの各ウェルに、2Xバッファー、プライマー、酵素、DNase/RNase遊離水、および対応するRNA混合物をピペットで移します。
プレートを粘着プレートシールでシールします。次に、プレートを1分間遠心分離して、ウェルの底に液体を回収します。次に、実験タイプを標準曲線に設定した高速96ウェルブロックタイプを受け入れるようにPCRマシンをプログラムします。
試薬を TaqMan reagents に設定し、標準分析プロパティを選択します。遺伝子ターゲットとレポーター色素を定義します。次に、テストする各反応のサンプル名を定義し、ターゲットとサンプルをプレートレイアウトに割り当てます。
次に、サイクルプログラムを機器に入力します。プレートを正しい向きでリアルタイムqPCRマシンに移し、実行を押してサイクルを開始します。実験データを保存するファイルの場所を選択します。
次に、qPCRプログラムによって提供される増幅プロットを調べます。開発された2つのキットは、1反応あたりわずか10個のRNAコピーで、3つの標的遺伝子すべてを同時に増幅することに成功しました。すべてのウイルス滴定の増幅効率は99%を超えました
