まず、単離した血漿サンプルを摂氏37度で解凍します。各血漿サンプル100マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移します。各チューブに1ミリリットルのカルシウムフリーHBSA緩衝液を添加します。
サンプルを 20 、 000 g で 4 °C で 15 分間遠心分離します。ペレットを乱すことなく上清を20マイクロリットルに吸引します。次に、カルシウムフリーのHBSA緩衝液1ミリリットルを各チューブに加えます。
次に、ピペットで上下にピペットしてペレットを再構成します。各チューブを数秒間ボルテックスして、細胞外小胞が均等に分布するようにします。次に、20, 000 gで摂氏4度で15分間遠心分離します。
ここでも、ペレットを乱さずに上清を20マイクロリットルに吸引します。次に、ペレットを80マイクロリットルのカルシウムフリーHBSA緩衝液で再溶解します。懸濁液を上下にピペットで動かして、均一な懸濁液にします。
細胞外小胞組織因子活性を測定するには、まず、40マイクロリットルの細胞外小胞サンプルを96ウェルプレートの2つのウェルにピペットで移します。最初のウェルに、11マイクロリットルの阻害性マウス抗ヒトTF IgGを添加します。もう一方のウェルに、11マイクロリットルのコントロールマウスIgGを添加します。
インキュベーション後、50マイクロリットルの因子混合溶液を各ウェルに加えます。プレートをフィルムで覆い、プレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。25マイクロリットルのHBSA EDTA緩衝液を添加して、因子Xaの生成を停止します。
発色基質を蒸留水中で4ミリモルの濃度に再構成します。次に、25マイクロリットルの発色基質を各ウェルに加えます。プレートをフィルムで覆い、アルミホイルで包みます。
プレートを摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、プレートを1, 500 gで1分間遠心分離し、気泡を取り除きます。次に、プレートを405ナノメートルのプレートリーダーに入れます。
再置換された組換え組織因子で生成された検量線を使用して、各ウェルの因子Xa生成を変換します。次に、組織因子依存因子Xa生成を計算します。11人のドナーのうち6人は中程度から高リポ多糖レスポンダーであり、11人中5人は低リポ多糖レスポンダーであった。
