インタクトな患者由来オルガノイドのプレーティングとマルチプレックス生細胞イメージングのためのイメージングパラメータの設定

まず、患者由来のオルガノイドまたはPDO懸濁液を同量の基底膜抽出物(BME)に入れたチューブを服用します。20マイクロリットルのピペットを使用して、予め温めた96ウェルプレートの各ウェルの中央に5マイクロリットルのドームを播種します。すべてのウェルに種をまいた後、プレートに蓋をして静かに反転させます。

反転したプレートを組織培養インキュベーターで摂氏37度で20分間インキュベートし、ドームを固化させます。蓋が上を向くようにプレートを裏返します。その後、再びインキュベートします。

PDOを含むプレートに蛍光染料と薬剤を添加した後。プレートを引用5に配置します。Gen5ソフトウェアを起動し、タスクマネージャーウィンドウでイメージャー手動モードを選択し、[今すぐキャプチャ]をクリックします。

設定で、対物レンズ、フィルター、マイクロプレートフォーマット、容器タイプを指定し、蓋を使用し、キャリア速度を遅くするを選択して、OKをクリックします。次に、関心のある井戸を選択します。明視野チャンネルを選択し、自動露出をクリックして、必要に応じて設定を調整します。

Zスタックを設定するには、次にイメージングモードタブを展開し、Zスタックを選択し、すべてのPDOの焦点が合わなくなるまでコース調整矢印を使用してフォーカスを調整します。この点を Z スタックの一番下として設定し、逆に繰り返して一番上を設定します。その後、イメージングの編集ステップを開いて蛍光チャンネルを設定します。

チャンネル数を選択し、明視野に1チャンネル、蛍光チャンネルごとに追加チャンネルを指定します。OKをクリックしてウィンドウを閉じ、ドロップダウンメニューをGFPに変更して最初の蛍光チャンネルの露出を設定し、自動露出をクリックして、露出タブで露出設定を調整してバックグラウンド信号を低減します。露出設定を画像モードタブにコピーするには、コピーアイコンをクリックし、[イメージングステップの編集]をクリックして新しいウィンドウを開きます。

GFPチャンネルで、露光線のクリップボードアイコンをクリックして、照明、積分時間、カメラゲインの設定をチャンネルに追加します。次に、カメラアイコンをクリックし、[処理ステップの追加]で[画像の前処理]を選択します。明視野タブで、[画像前処理の適用] オプションのチェックを外します。

各蛍光チャンネルタブで、Apply image pre-processingにチェックが入っていることを確認します。選択を解除し、チャンネル 1 と同じオプションを使用してから、「OK」をクリックしてウィンドウを閉じます。次に、処理の追加ステップでZ投影をクリックし、必要に応じてスライス範囲を調整し、[OK]をクリックしてウィンドウを閉じます。

キネティックイメージングのプロトコルを設定するには、ツールバーで[画像セット]をクリックし、ドロップダウンメニューから[この画像セットから実験を作成]を選択します。他の見出しの下にあるオプションをクリックし、不連続なキネティックプロシージャボックスにチェックを入れます。[推定合計時間] に、実験の実行時間を入力します。

[OK]をクリックしてウィンドウを閉じます。さらに、この時点でプレートレイアウトと温度勾配を設定します。ウィンドウをクリックして、データ削減手順を検証します。

次に、ファイルに移動し、ツールバーの[名前を付けてプロトコルを保存]をクリックします。保存場所を選択します。ファイル名を入力し、「保存」をクリックします。

キネティックイメージングを開始するには、プロトコルをバイオスパオンデマンドスケジューリングソフトウェアにロードし、利用可能なスロットを選択します。「プロシージャー情報」タブで、メニューから「ユーザー」を選択します。プロトコルスロットの横にある [select] をクリックし、[add a new entry] を選択します。

次に、プロトコルスロットの横にある[選択]をクリックします。[開く(Open)] をクリックしてプロトコルをナビゲートし、スケジューリング ソフトウェアにインポートします。プレートに必要なイメージング時間を入力し、[OK]をクリックしてウィンドウを閉じます。

間隔(interval)で、必要なイメージングの頻度を入力し、スケジュール、プレート、または容器を選択してプレートバリデーションシーケンスを開始し、はいをクリックしてこのスケジュールを受け入れます。