まず、実験用の浴室に清潔なスライドガラスを取り付けます。スライドに2〜3マイクロリットルのラミニンをコーティングし、30秒間乾燥させます。次に、約400マイクロリットルの筋線維懸濁液をスライドに注ぎ、繊維を10〜15分間ラミニンに付着させます。
落射蛍光用の倒立顕微鏡のステージに実験チャンバーを置きます。繊維の生存率を検証するには、実験チャンバーの両側に2つの白金電極を配置します。矩形電流パルスを0.8〜1.2ミリ秒印加した後、筋線維の収縮を極端に観察します。
3.5〜4.5マイクロモルの高速カルシウム色素Mag-Fluo-4 AMをチローデ溶液に4〜5分間ロードします。スライドをチロード溶液で洗浄した後、暗所で15〜20分間、細胞内色素を脱エステル化させます。調光照明下でのカルシウム過渡現象の取得中に、油浸40倍対物レンズとデジタイザーに接続された光電子増倍管を使用して光信号を収集して保存します。
集録ソフトウェアでは、0 から 200 の任意の単位のスケールを確保します。次に、励起スポットのサイズと光電子増倍管のゲインを調整して、静止蛍光(F-rest)を任意の10単位に設定します。記録を解析するには、トレース全体にローパスフィルターを1キロヘルツで設定します。
次に、ピークを調整して、トレースの 1 秒間の F レストを計算します。Fレストをゼロに調整し、筋形質カルシウム過渡現象のピーク振幅を測定します。振幅の10%から90%までの立ち上がり時間、半値での持続時間、振幅の90%から10%までの減衰時間を測定します。
次に、双指数関数による近似に従って減衰速度論を推定します。マイクロモルのピークカルシウム濃度を計算します。最後に、減衰 tau 1 と tau 2、振幅 A1 と A2 の時定数の値を保存します。FDBおよびEDL筋は、形態II型ヒラメ筋として知られるカルシウム動態を示し、形態型I型カルシウム過渡現象を示しました。
PDQA、PL、およびEHL筋の線維は、II型形態を共有していました。カルシウム過渡期のPDQA、PL、およびEHLの運動信号は、FDB EDL筋の信号に類似していましたが、ヒラメ筋の信号とは異なっていました。
