まず、特異的プライマー515fおよび806rを用いて、16S rNA遺伝子のV4超可変領域を増幅する。所定の条件でPCRを行います。次に、3.5マイクロリットルのシーケンシングバッファーと1.5マイクロリットルの酵素ミックスをチューブに加えます。
サンプルを混合して回転させた後、サーモサイクラー反応をセットアップします。次に、アダプターライゲーション混合物をチューブに加え、サーモサイクラーで摂氏20度で15分間インキュベートします。1.5マイクロリットルのウラシル特異的伸長試薬酵素をライゲーションミックスに加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。
次に、アダプターライゲーションDNAに43.5マイクロリットルの磁気ビーズを加え、20回混合します。5分後、チューブを磁気ラックに5〜10分間入れてビーズ分離し、上清を廃棄します。ペレットを100マイクロリットルの80%エタノールで洗浄し、ビーズを30秒間乾燥させます。
ビーズをペレットに溶出させるには、8.5マイクロリットルの10ミリモルトリス塩酸をチューブに加え、2分間インキュベートします。チューブを磁気ラックに置き、7.5マイクロリットルの抽出したDNAを上清として新しいチューブに移します。PCR試薬をアダプターライゲーション済みDNA含有チューブに添加し、25マイクロリットルの反応をセットアップします。
増幅したDNAを洗浄するには、22.5マイクロリットルの磁気ビーズをチューブに加え、20回混合します。5分後、50マイクロリットルの上澄み液を取り除き、100マイクロリットルの80%エタノールでビーズを洗浄します。暗褐色のビーズを16マイクロリットルの水に再懸濁し、20回混合します。
チューブを磁気ラックに30〜60秒間置き、15マイクロリットルを新しいチューブに移します。90マイクロリットルの緩衝液、1マイクロリットルの色素、および2マイクロリットルのDNAライブラリーサンプルを混合し、蛍光度計でDNA濃度を読み取ります。DNAを2ナノモルに希釈した後、27〜30マイクロリットルのフローセルをロードし、シーケンサーに入れます。
シーケンサーから取得したFASTQファイルを保存します。クリックすると、スプレッドシート ファイルが開き、マッピング ファイルまたはメタデータ ファイルが作成されます。Nephele の Web サイトを開き、FASTQ ファイルをアップロードして、QC End QIIME2、フィルタリングとトリミングの実行をお読みください。
次に、DADA2を使用して、逆多重化されたペアエンドリード、フィルター置換、キメラエラー、およびマージを実行します。Silva バージョン 132 の 99% 操作分類単位 (OTU データベース) でトレーニングされた単純ベイズ分類器を使用して、97% の類似性で細菌の分類学的割り当てを実行します。MicrobiomeDBのWebサイトを開きます。
クリックしてファイルをアップロードし、OTU アルファの多様性、ベータの多様性、相対存在量、希薄化曲線を生成します。最後に、スプレッドシートを開いてデータを転送し、ヒートマップ、ベン図、線形判別分析の効果サイズを作成します。ワイン製造のさまざまな段階におけるバクテリアの相対的な存在量に基づくヒートマップは、プロテオバクテリア、放線菌、フィルミキューテス、バクテロイドタ、フソバクテリオタなどの門の優勢を示しました。
属レベルでは、腸内細菌科や乳酸菌科などの重要な属が同定されました。ベン図分析により、ブドウの果汁から最終的なワインまで、15の共通する固有のOTUが明らかになりました。V4可変領域に基づくアンプリコンシーケンシングの結果、2つのトラミネットRおよびL.Beta多様性分析では、発酵中に細菌のシフトが示されましたが、最終的なワインの細菌組成は、マストおよび酵母添加段階の細菌組成と同様でした。
