まず、ろ紙を約17×20ミリの長方形に切り、四隅を取り除きます。次に、ろ紙に約7×10ミリメートルの中空の中心を作成します。市販のリングを可撓性フィルム層に取り付け、可撓性フィルム層に中空の中心を作ります。
準備したリングを35ミリメートルのシャーレに入れます。予備培養後、インキュベーターから卵を取り出し、卵パックトレイの長軸上に置きます。卵殻の表面全体を70%エタノールできれいにし、15分間休ませます。
卵を短軸で持ち、底を割る。きれいな100ミリメートルのシャーレで卵を開き、中身を取り出します。ピペットを使用して、約10ミリリットルの薄いアルブミンを15ミリリットルのチューブに移し、ex ovo培養を行います。
培養皿の中央の井戸を薄いアルブミンで満たします。ティッシュペーパーを使用して、胚の硝子体膜に付着している厚いアルブミンをそっと取り除きます。次に、濾紙をビテリン膜に慎重に貼り付け、胚の体軸が濾紙の中央の長方形に揃うようにします。
ろ紙を囲む膜をハサミで切ります。ピンセットを使用して、孤立したろ紙をヨークから斜めにそっと引き離します。ろ紙を逆さまにして、胚の背側を下にして配置します。
濾紙全体を長軸の片側から、洗浄液の入った100ミリメートルのシャーレに慎重に浸します。清潔なピペットを使用して、濾紙と平行に洗浄媒体を静かにスプレーし、残留卵黄を取り除きます。次に、濾紙を洗浄培地から慎重に取り除き、ティッシュペーパーを使用して胚の端から余分な培地を吸収します。
胚の入ったろ紙を培養皿に置き、胚の背側が下を向くようにします。培養皿をステージ上のインキュベーターに移し、ex ovo培養を行います。培養皿に温かい洗浄液を入れます。
胚が所望の発育段階に達したら、胚の入った濾紙を洗浄培地で満たされた培養皿に移します。培養皿をブリルアン顕微鏡のステージ上のインキュベーターに入れます。キャリブレーションプロセスでは、水のブリルアン信号を測定します。
次に、メタノールのブリルアン信号を測定します。4倍の対物レンズを使用した明視野イメージングでは、レーザー照射点を2対目の体節に調整します。その後、40倍の対物レンズに切り替えて、神経管の真ん中にレーザーポイントを微調整します。
レーザービームのブロックを解除し、焦点面を調整します。2次元翻訳ステージを使用して胚をスキャンし、関心領域のブリルアン画像を取得します。スキャンが完了したら、胚の入ったろ紙を慎重に取り除きます。
ティッシュペーパーを使用して、胚から余分な洗浄培地を吸収します。胚を薄いアルブミンで満たされた培養皿に戻し、連続培養します。ブリルアン画像の再構成では、水とメタノールの信号データを読み込みます。
set regionをクリックし、キャリブレーションパラメータを計算するための4つのドットの領域を選択します。キャリブレーション結果を保存します。胚スキャンデータを読み込み、パラメータの処理のために[開始]をクリックします。
最後に、すべてのピクセルのブリルアン シフトに基づいて 2 次元ブリルアン イメージを再構成します。体節数とインキュベーション時間に対する神経板の推定縦弾性率のブリルアンシフトは、神経管閉鎖中の組織のブリルアンシフトの増加を示しました。
