コンゴレッド色素を含む寒天プレート上の3ストリーク赤痢菌株により、コロニーが毒性があることを確認し、感染アッセイでの非毒性コロニーの使用を防ぎます。まず、一晩で培養した赤痢菌の培養物を取り、ボルテックスします。培養チューブ内の5ミリリットルの新鮮なTSBに100マイクロリットルの培養物を加えます。
600ナノメートルで光学濃度0.7に達するまで、250RPMで振とうしながら、摂氏37度で培養物をインキュベートします。継代培養した赤痢菌の8つのコロニー形成ユニットに10倍2回、2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。室温で2分間、17, 000 gで遠心分離することにより、細胞をペレット化する。
上澄みを吸引する。1ミリリットルの温かいPBSを加え、ペレットを完全に再懸濁します。細胞を再び遠心分離した後、ペレットを2ミリリットルの温かいDMEMに再懸濁し、細胞懸濁液をボルテックスします。
次に、1ミリリットルの再懸濁赤痢菌と1ミリリットルのDMEMを、6枚のウェルプレートのHT29結腸上皮単層の各ウェルに加えます。HT29細胞との細菌接触を確実にするために、室温または摂氏37度で10分間、2, 000 gで6枚のウェルプレートを遠心分離します。6枚のウェルプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で45分間インキュベートします。
細菌感染力価を決定するには、再懸濁した赤痢菌細胞をPBSで10倍段階希釈液を調製します。10倍から5倍、10倍から6希釈の100マイクロリットルをTSBでコンゴレッドプレートに播種し、摂氏37度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルから培地を吸引します。
各ウェルに1ミリリットルの温かいPBSを加え、穏やかに洗浄します。次に、2ミリリットルの温かいDMEMと1ミリリットルあたり50マイクログラムのゲンタマイシンを加え、5%の二酸化炭素と摂氏37度で30分間インキュベートします。感染したHT29細胞を1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。
ゲンタマイシンを含む2ミリリットルの温かいDMEMを各ウェルに加え、5%の二酸化炭素で37°Cで細胞内複製のために最大24時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、1ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。1%Triton X-100を含むPBSを1ミリリットル各ウェルに添加し、HT29細胞を溶解します。
次に、細胞スクレーパーまたは曲がったピペットチップを使用して、溶解した細胞をウェルの底から掻き取り、混合物を1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。各チューブを少なくとも30秒間ボルテックスして、溶解した真核細胞から赤痢菌をさらに置換します。ライセートとPBSの10倍段階希釈液を調製します。
100マイクロリットルの段階希釈液をTSBでコンゴレッドプレートに播種し、摂氏37度で一晩インキュベートします。
