CLEM用ナビゲーションマップの作成と電子顕微鏡用極薄切片の作製

まず、mScarletを発現するマウスの脳組織の極薄切片を採取します。カバーガラスの極薄部分に10マイクロリットルの取り付けバッファーを追加し、新しい清潔なカバーガラスを取り付けバッファーに置きます。極薄部分の2つのカバーガラスをイメージングチャンバーに入れます。

倒立蛍光顕微鏡の明視野イメージングモードで環状マーカーを使用して切片の位置を特定し、切片の片隅に移動します。白色光をオンにして、明視野画像をキャプチャします。次に、白色光をオフにします。

レーザーを作動させ、同じ視野の蛍光画像を撮影します。レーザーを無効にし、10%のオーバーラップで隣接する視野に移動します。第2視野の明視野画像と蛍光画像の両方を撮影し、視野をつなぎ合わせるための撮像経路を記録します。

次に、ナビゲーション マップを使用して、関心のあるセルをターゲットにします。レーザーを作動させ、目的の細胞の蛍光画像を300フレーム撮影します。次に、レーザーを無効にします。

その後、白色光をアクティブにし、約100枚の連続明視野画像を撮影します。電子顕微鏡用の切片を準備するには、ガラス瓶に二重蒸留水を入れます。極薄切片を固定しているカバーガラスをイメージングチャンバーから取り外し、ピンセットで分離します。

カバーガラスをセクションに固定します。取り付けバッファーを二重蒸留水で洗い流し、乾燥させます。片面ブレードを使用して、極薄部分の周りのハッシュをスコアリングします。

スコアの各コーナーに10マイクロリットルの12%フッ化水素酸をドロップします。カバーガラスをゆっくりと水に入れます。次に、ピオロホルムフィルムと極薄切片を水面に浮かべます。

セクションにコーティングされていないスロットグリッドを配置して、グリッド中央にキャプチャします。スライドガラスをパラフォームで覆います。ピオロホルムフィルムでグリッドをピックアップし、室温で風乾させます。