幹細胞ベースの治療のための培養H9胚性幹細胞からの3D神経網膜形成の誘導

まず、H9胚性幹細胞を融解し、Y-27632を含む維持培地で培養します。0日目に、コロニーが70%コンフルエントになったら、2ミリリットルのDPBSで洗浄し、次に20マイクロモル/リットルY-27632を含む0.5ミリリットルの細胞解離溶液で細胞をインキュベートします。消化を中止するには、1リットルあたり20マイクロモルのY-27632を含む3ミリリットルの維持培地を追加します。

細胞をペレット化するには、チューブを190 Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。ペレットをY-27632を含む1ミリリットルの成長因子を含まない化学的に定義された培地に再懸濁します。細胞を数えた後、120万個の細胞を10ミリリットルの成長因子を含まない化学的に定義された培地に添加し、よく混合します。

次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェル円錐形底板の各ウェルに分注します。加湿した5%二酸化炭素雰囲気でインキュベートします。6日目に網膜形成を誘導するには、BMP4を含む培地を96ウェルV底板の各ウェルに添加し、再度インキュベートします。

9日目、12日目、および15日目に、使用済み培地の半分をBMP4を含まない新しい培地と交換します。18日目に、形成された胚様体を15ミリリットルの遠心チューブに慎重に移します。胚様体が自然に沈殿した後、上澄み液を静かに除去し、神経網膜分化培地ですすいでください。

次に、胚様体を低吸収の6ウェルプレートに入れ、プレートを再度インキュベートします。21日目に、明視野画像は、この方法を使用して生成された神経網膜の連続的な神経上皮構造を示しました。網膜誘導の成功率は有意に高く、このプロトコルを使用して生成された網膜オルガノイドは、他の方法と比較してサイズと形態が類似していました。