カイモグラフの生成と生 Caenorhabditis elegans ワームにおける個々の輸送イベントの測定

まず、DA9軸索のシナプス異常領域における内因性GFP Rab3のタイムラプスを、生きた線虫Caenorhabditis elegansに記録します。タイムラプスデータファイルをフィジーにインポートします。次に、画像取得中に動物または軸索セグメントの動きやわずかなドリフトを確認します。

StackReg プラグインと剛体変換オプションを使用して、動きやドリフトを修正します。セグメント化されたラインツールを使用し、軸索の直径に合わせて線幅を調整します。セグメント化された線のアイコンをマウスの左ボタンでダブルクリックすると、分析のために軸索セグメントに沿って線を描きます。

次に、フィジーのプラグインKymoResliceWideを使用して、キモグラフを生成し、パラメータ設定で線の幅方向の最大強度値を設定します。直線ツールを使用して、キモグラフで輸送イベントをトレースします。個々のトランスポート イベントをトレースし、各行を ROI マネージャーに保存します。

フィジーでは、面積、外接する長方形、平均グレー値、フェレットの直径などの測定パラメータを選択します。次に、結果テーブルをスプレッドシートに貼り付けて計算します。幅にカメラの解像度を掛けて、実行距離をマイクロメートルで求めます。

移動イベントの期間を決定するには、高さに連続する時間ポイント間の取得時間を掛けます。一時停止時間を、速度がゼロの 2 つの連続する動きの間の実行時間として計算します。イベントの合計を、1分あたりのイベント数と軸索長セグメントのキモグラフの全長に正規化します。

[フェレット角度] ツールを使用して、イベントを順行性輸送と逆行性輸送に分類します。近位から遠位にセグメント化された線を描画して生成されたキモグラフの場合、フェレット角を使用して各イベントの方向性を決定します。